Evaluering af effektiviteten af ​​klorokin til behandling af Plasmodium Vivax-infektioner i det centrale Vietnam

3.1 Undersøgelsesdesign Dette studie er designet som et 42-dages lægemiddeleffektivitetsstudie for at evaluere kliniske og parasitologiske responser efter behandling af P.vivax malariainfektioner. Symptomatiske patienter med P. vivax mono-infektioner, der opfylder undersøgelseskriterierne, vil blive optaget i undersøgelsen og behandlet med CQ (samlet dosis 25gm/kg over 3 dage). Behandlingen vil blive observeret direkte, og patienterne vil blive fulgt aktivt op i 42 dage i henhold til en udvidet WHO-protokol. Ved afslutningen af ​​opfølgningstiden vil alle patienter blive behandlet med primaquine efter nationale retningslinjer for radikal helbredelse af P.vivax-infektioner.

3.2 Undersøgelsessted og befolkning Undersøgelsen vil blive udført i Krong Pa-distriktet, Gia Lai-provinsen, hvor både P.falciparum og P.vivax malariaforekomst er blandt de højeste i landet. Undersøgelsen vil blive placeret i Chu'R Cam kommune, hvor undersøgelsesholdet vil arbejde med det lokale sundhedspersonale og alle omkringliggende kommuner med malariapatienter.

Den lokale befolkning består hovedsageligt af det etniske mindretal JaRai, og hovedbeskæftigelsen består af slash and burn landbrug (hovedsageligt majs, maniok og ris) i skovmarker, sammen med sæsonarbejde i gummiplantager og småskala produktion af varer til daglig. underhold eller handel f.eks. kaffe og cashewnødder. Klimaet er tropisk med tørsæsonen fra november til april og regntiden fra maj til oktober. Området er bakket og skovklædt (sekundær skov), og den vigtigste malariavektor er Anopheles dirus.

3.4 Forsøgspopulation Målpopulationen omfatter alle P.vivax-inficerede patienter (børn og voksne), der enten præsenterer sig spontant på CHC eller identificeres gennem aktiv screening i samfundet.

3.5 Forsøgsprocedurer 3.5.1 Screening og rekruttering Alle konsulterende patienter, der opfylder de grundlæggende tilmeldingskriterier under screeningen, vil blive tildelt et fortløbende screeningsnummer og evalueret mere i dybden af ​​lægen. Når patienten opfylder alle tilmeldingskriterierne, vil han eller hun (eller en forælder eller værge i tilfælde af børn) blive bedt om samtykke til at deltage i undersøgelsen. Derefter vil han/hun få tildelt et studienummer (ID=sekventiel nummerering). Enhver person, der beslutter sig for ikke at deltage i undersøgelsen, vil blive undersøgt, behandlet og fulgt op af sundhedsinstitutionens personale i henhold til den plejestandard, som er fastsat af Sundhedsministeriet.

Ved indskrivning (dag 0) vil patienten blive og undersøgt og et standardiseret præ-kodet spørgeskema vil blive udfyldt. En venøs blodprøve vil blive opsamlet i sterile vacutainer-rør indeholdende EDTA eller syre-citrat-dextrose (EDTA/ACD) fra alle patienter ved indskrivning. Der vil blive indsamlet minimum 5 ml blod - og maksimalt 8 ml - fra voksne, og 1 ml/kg op til 5 ml vil blive indsamlet fra børn. To bloddråber tilsættes i et 1,5 ml rør indeholdende 500 µL RNAprotect-reagens (Qiagen).

3.5.2 Behandling Alle patienter vil modtage en fuld behandling med CQ i en dosis på 25 mg CQ base pr. kg kropsvægt givet over 3 dage og under direkte supervision. Patienter vil blive observeret i 60 minutter efter behandling for bivirkninger eller opkastning. De patienter, der kaster deres medicin op inden for de første 30 minutter, vil modtage en gentagen fuld dosis; dem, der kaster op fra 30-60 minutter, vil få halv dosis. Hvis patienten kaster op igen, vil han eller hun blive trukket tilbage og tilbudt redningsterapi.

Redningsmedicin:

Oral=CQ (3 dage, 25 mg/kg) sammen med primaquin (0,25 mg/kg/dag i 14 dage); Intravenøs (IV)= Artesunate (4mg/kg/dag) i minimum 24 timer og indtil patienten er i stand til at tage oralt lægemiddel. Fortsæt derefter med oral DHA-PPQ i 3 dage.

Radikal kur. primaquine-behandlingen vil blive forsinket til slutningen af ​​opfølgningen og givet som anbefalet af de nationale retningslinjer, dvs. 0,25 mg/kg/dag i 14 dage til alle patienter med negativ G6PD-hurtigtest.

3.5.3 Opfølgning Fra dag 0 indtil parasitclearance patienter vil blive monitoreret hver 12. time ved blodmikroskopi mindst indtil dag 3 og længere om nødvendigt indtil parasitclearance defineret som to på hinanden følgende negative dias.

Ved hvert besøg vil patienten blive interviewet og undersøgt, og der vil blive udtaget en fingerprikkeblodprøve for følgende resultater: to blodglas til LM-observation (tyk og tynd film), 200 μl blod i et EDTA/ACD mikrotainerrør til DNA ekstraktion og 2 dråber blod i et andet mikrotainerrør indeholdende RNAprotect til RNA-ekstraktion. På dag 3 vil der blive taget en ekstra dråbe blod for at måle Hb-koncentrationen med Hemocue-metoden.

Dag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Patienterne vil blive interviewet og undersøgt, opfølgningsskemaet vil blive udfyldt, og enhver uønsket hændelse vil blive dokumenteret. En blodprøve med fingerprikker vil blive indsamlet for følgende resultater: to blodglas til LM-observation (tyk og tynd film), 200 μl blod i et EDTA/ACD-mikrotainerrør til DNA-ekstraktion og 2 dråber blod i RNAprotect-indeholdende mikrotainerrør .

Derudover vil der på dag 7 blive taget 100μl blod på filterpapir for at bestemme blodets CQ-koncentration. På dag 7, 14, 28 og 42 vil Hb-koncentrationen (Hemocue) blive målt fra fingerstik.

Dag for P.vivax-tilbagefald: Hvis tilbagefald bekræftes, vil der blive udtaget en yderligere venøs blodprøve før administration af redningsbehandling. 100 μl af dette venøse blod vil blive spottet på filterpapir for at bestemme blodets CQ-koncentration, resten bruges til ex vivo-assay og kryokonservering som beskrevet i bilag VI-C.

3.5.4 Tab ved overtrædelser af opfølgningsprotokol. Tab til opfølgning opstår, når en indskrevet patient trods alle rimelige anstrengelser ikke deltager i de planlagte besøg og ikke kan findes. Ingen behandlingsresultater vil blive tildelt disse patienter. Disse patienter vil blive klassificeret som tabt til opfølgning og censureret eller udelukket fra analysen.

Undersøgelsespatienter, der opfylder et af følgende kriterier, vil blive klassificeret som trukket tilbage: i) tilbagetrækning af samtykke; ii) manglende fuldførelse af behandlingen; iii) alvorlige bivirkninger, der nødvendiggør afbrydelse af behandlingen, før hele forløbet er afsluttet; iv) overtrædelse af tilmelding; v) frivillig overtrædelse af protokol; vi) ufrivillig protokolbrud

3.5.5 Laboratorieprocedurer og evaluering Mikroskopi Tre objektglas (tynde/tykke blodudstrygninger) bør opnås ved screening, hvoraf den ene farves hurtigt (10 % Giemsa i 10 minutter) til undersøgelse i et begrænset antal felter for at sikre tilstedeværelsen af ​​P.vivax aseksuelle former ved et minimum parasitæmi på 250/ul. Når patienten er indskrevet, vil de to andre objektglas blive farvet mere omhyggeligt (3 % Giemsa i 45 min). Densitet, vil blive udtrykt som antallet af aseksuelle parasitter pr. µl blod, og beregnet ved at dividere antallet af aseksuelle parasitter med antallet af WBC'er, der er talt og korrigeret med den estimerede WBC's tæthed (typisk 8000 pr. µl). Når antallet af aseksuelle parasitter er mindre end 10 pr. 200 WBC'er, vil der blive tællet mod mindst 500 WBC'er. Et blodglas vil blive betragtet som negativt, når undersøgelse af 1000 WBC'er afslører ingen aseksuelle parasitter.

• Ringstadium parasitæmi: Antallet af ringstadier tælles i alle positive objektglas på dag 0 og på dagen for tilbagefald mod 200 aseksuelle parasitter; kun isolater, hvor andelen af ​​ringstadier overstiger 65 %, vil blive brugt til ex vivo-lægemiddelassayet.
• Gametocytter: tætheden vil blive beregnet ved at tælle antallet af gametocytter pr. 500 WBC'er.

Hæmoglobinniveauer Hb-niveauer vil blive målt på fuldblod opsamlet i mikrokuvette ved hjælp af Hemocue efter producentens instruktioner.

Måling af CQ-koncentration på dag 7 og dag for tilbagefald fra 100 µl blod udstødt på kromatografipapir (31ETCHR, Whatman) Parasitmolekylær detektion og genotypebestemmelses-DNA vil blive ekstraheret ved ITM/NIMPE fra fingerprikkede blodprøver indsamlet i mikrotainere. Molekylær bekræftelse af Plasmodium-arter på dag 0 vil blive udført ved hjælp af qPCR rettet mod 18S ribosomalt gen. Den samme qPCR-metode vil blive brugt til at identificere og kvantificere P. vivax-infektioner på dag 0 og følge op på prøver.

P. vivax-genotyper vil blive identificeret gennem PCR-amplifikation af 3 markører, der er særligt effektive til fingeraftryk i kliniske forsøg (MS16, Pv3.2 og msp1F3) efterfulgt af kapillær gelelektroforese.

RNA-ekstraktion og RT-qPCR for gametocytter RNA vil blive ekstraheret fra RNAprotect-prøver ved ITM/NIMPE ved hjælp af affinitetssøjler og DNAse-fordøjelse af genomisk DNA. For at detektere og kvantificere P. vivax-gametocytstadier vil en revers transkription qPCR (RT-qPCR) rettet mod Pvs25-gentransskriptioner blive udført på D0 og i alle opfølgningsprøver.

Lægemiddelresistens laboratorieanalyse (dag 0 og for recidiv) Kort fortalt vil blod blive centrifugeret, og plasma vil blive opbevaret ved -20ºC. Den øverste del af buffy coat fjernes forsigtigt og opbevares ved -20ºC. Røde blodlegemer (RBC'er) vil blive resuspenderet i PBS (1:1), og leukocytter vil blive udtømt ved hjælp af cellulosesøjler (Sigma). Filtrerede celler vaskes og pellets måles før resuspendering ved 50 % hæmatokrit i McCoy-medium (blodmediumblanding, BMM, 4 ml).

Ex vivo lægemiddelfølsomhedsassays: Kort fortalt vil plader med foruddoserede 7-punkts 2-fold fortyndinger af CQ, PPQ, DHA og kinin blive forberedt efter WWARN-procedurer [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Minimale hæmmende koncentrationer og IC50 vil blive beregnet ved hjælp af In Vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) udviklet online af WWARN.

G6PD-mangeltest: alle patienter vil blive testet for G6PD-mangel ved hjælp af point-of-care-testen fra CareStart (Access Bio, New Jersey, USA) før PQ-behandling.

4. Kvalitetssikring Stedsovervågningsbesøg vil blive planlagt regelmæssigt. Under disse besøg vil oplysninger, der er registreret på sagsrapportformularerne, blive verificeret i forhold til kildedokumenter. Efter at sagsrapportformularerne er samlet ved afslutningen af ​​retssagen, vil de blive gennemgået for fuldstændighed og nøjagtighed. Dataene vil blive dobbeltindlæst i en elektronisk database, hvor specialdesignede computertjek bruges til at identificere udvalgte protokolbrud og datafejl.

Alle blodfilm ved indlæggelse vil blive læst på studiestedet samt af en seniormikroskopist på et koordinerende center. Derudover vil der blive foretaget en ekstern kvalitetskontrol hos ITM på 10 % af tilfældigt udvalgte slides. For hver af de molekylære assays (qPCR, RT-qPCR og parasit genotyping) vil 10 % af prøverne behandlet ved NIMPE blive tilfældigt udvalgt til at blive genanalyseret ved ITM. Ekstern kvalitetskontrol af ex vivo lægemiddelanalyseresultater vil blive udført på ITM, hvor objektglassene vil blive genundersøgt for 10 % af tilfældigt udvalgte isolater.

5. Statistisk analytisk plan Analysen af ​​dag 42 helbredelsesraten vil blive udført både for intention-to-treat (ITT) patientpopulationen og den evaluerbare patientpopulation (Per Protocol). Dataanalyser vil blive udført ved hjælp af STATA 12 software. For kategoriske variable vil procenter og tilsvarende 95 % konfidensintervaller blive beregnet efter Wilsons metode. Proportioner vil blive sammenlignet ved at beregne *2 med Yates' korrektion eller ved Fishers eksakte test, hvor det er relevant. Normalfordelte kontinuerlige data vil blive sammenlignet med Students t-test og variansanalyse. Data, der ikke er i overensstemmelse med en normalfordeling, vil blive sammenlignet med Mann-Whitney U-testen eller Kruskal-Wallis-variansanalysen. Korrelationen mellem 2 kontinuerte variable vil blive vurderet ved hjælp af enten Pearson eller Spearmans rangkorrelationskoefficient efter behov.

Den samlede risiko for behandlingssvigt på dag 28 og på dag 42 vil blive beregnet ved Kaplan Meier-metoden, og sammenligninger mellem risikogrupper vil blive udført ved hjælp af log rank test. Den PCR-justerede risiko på dag 28 og 42 vil også blive beregnet efter genotyperesultaterne for hver tilbagevendende P.vivax-infektion. Parasitrensningstid og -hastighed vil blive estimeret ved hjælp af PCE-onlineværktøjet udviklet af WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). Gennemsnitlig IC50 og IC90 for CQ vil blive estimeret ved hjælp af In vitro analyse- og rapporteringsværktøjet (IVART), udviklet af WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Hæmatologiske ændringer vil blive evalueret ved at måle ændringerne i Hb-koncentrationen mellem henholdsvis dag 0, 3, 7, 14, 28 og 42.

6. Etiske spørgsmål 6.1 Etisk godkendelse til at udføre undersøgelsen vil være opnået fra den etiske komité i NIMPE, Hanoi og fra den etiske komité på universitetet i Antwerpen, samt fra det institutionelle revisionsudvalg ved ITM, Anwerp.

6.2 Samtykkeproces Patienter vil kun blive inkluderet i undersøgelsen, hvis de (eller forældre eller værger til børn) giver informeret samtykke. Anmodningen om samtykke er tilgængelig på engelsk og oversat til vietnamesisk for at blive læst helt op for patienten, forælderen eller værgen. Detaljer om forsøget og dets fordele og potentielle risici vil blive forklaret. Når eventuelle spørgsmål er besvaret, vil der blive anmodet om en underskrift på dokumentet. Hvis patienten er analfabet, skal et læse- og skrivevidne skrive under; hvis det er muligt, vil underskriveren blive udvalgt af deltageren og vil ikke have nogen forbindelse til forskerholdet.