Hodnocení účinnosti chlorochinu při léčbě infekcí Plasmodium Vivax ve středním Vietnamu

3.1 Uspořádání studie Tato studie je navržena jako 42denní studie účinnosti léčiva k vyhodnocení klinických a parazitologických odpovědí po léčbě infekcí malárie P.vivax. Symptomatičtí pacienti s monoinfekcemi P. vivax, kteří splňují kritéria studie, budou zařazeni do studie a léčeni CQ (celková dávka 25 g/kg během 3 dnů). Léčba bude přímo sledována a pacienti budou aktivně sledováni po dobu 42 dnů podle rozšířeného protokolu WHO. Na konci doby sledování budou všichni pacienti léčeni primachinem podle národních doporučení pro radikální léčbu infekcí P.vivax.

3.2 Místo studie a populace Studie bude provedena v okrese Krong Pa v provincii Gia Lai, kde výskyt malárie P. falciparum i P. vivax patří k nejvyšším v zemi. Studie bude umístěna v obci Chu'R Cam, kde bude studijní tým spolupracovat s místním zdravotnickým personálem a všemi okolními komunitami s pacienty s malárií.

Místní obyvatelstvo se skládá převážně z etnické menšiny JaRai a hlavní zaměstnání spočívá v sekání a vypalování zemědělství (hlavně kukuřice, manioku a rýže) na lesních polích spolu se sezónními pracemi na kaučukových plantážích a drobnou výrobou zboží pro každodenní živobytí nebo živnost např. kávu a kešu oříšky. Podnebí je tropické s obdobím sucha od listopadu do dubna a obdobím dešťů od května do října. Oblast je kopcovitá a zalesněná (sekundární les) a hlavním přenašečem malárie je Anopheles dirus.

3.4 Populace ve studii Cílová populace zahrnuje všechny pacienty infikované P.vivax (děti a dospělí), kteří se buď spontánně dostavili na CHC, nebo byli identifikováni aktivním screeningem v komunitě.

3.5 Zkušební postupy 3.5.1 Screening a nábor Všem konzultujícím pacientům, kteří během screeningu splní základní kritéria pro zařazení, bude přiděleno průběžné screeningové číslo a lékař je bude hlouběji hodnotit. Jakmile pacient splní všechna vstupní kritéria, bude on nebo ona (nebo jeho rodič či opatrovník v případě dětí) požádána o souhlas s účastí ve studii. Poté mu bude přiděleno číslo studie (ID = pořadové číslování). Každá osoba, která se rozhodne studie neúčastnit, bude vyšetřena, ošetřena a sledována pracovníky zdravotnického zařízení podle standardu péče stanoveného Ministerstvem zdravotnictví.

Při zápisu (den 0) bude pacient vyšetřen a bude vyplněn standardizovaný předem nakódovaný dotazník. Vzorek žilní krve bude odebrán do sterilních vacutainerových zkumavek obsahujících EDTA nebo acid-citrát-dextrózu (EDTA/ACD) od všech pacientů při zařazení. Dospělým bude odebráno minimálně 5 ml krve – a maximálně 8 ml – a dětem 1 ml/kg až 5 ml. Dvě kapky krve se přidají do 1,5 ml zkumavky obsahující 500 µl činidla RNAprotect (Qiagen).

3.5.2 Léčba Všichni pacienti dostanou plnou léčbu CQ v dávce 25 mg báze CQ na kg tělesné hmotnosti (bw) podávané po dobu 3 dnů a pod přímým dohledem. Pacienti budou sledováni po dobu 60 minut po léčbě kvůli nežádoucím reakcím nebo zvracení. Pacienti zvracející léky během prvních 30 minut dostanou opakovanou plnou dávku; ti, kteří zvracejí od 30-60 minut, dostanou poloviční dávku. Pokud pacient znovu zvrací, bude stažen a nabídnuta záchranná terapie.

Záchranné léky:

Orální = CQ (3 dny, 25 mg/kg) spolu s primachinem (0,25 mg/kg/den po dobu 14 dnů); Intravenózní (IV) = Artesunate (4 mg/kg/den) po dobu minimálně 24 hodin a dokud pacient není schopen užívat perorální lék. Poté pokračujte v perorálním podávání DHA-PPQ po dobu 3 dnů.

Radikální léčba. Léčba primachinou bude odložena až do konce sledování a bude podávána podle doporučení národních doporučení, tj. 0,25 mg/kg/den po dobu 14 dnů všem pacientům s negativním rychlým testem G6PD.

3.5.3 Sledování Ode dne 0 až do vymizení parazitů budou pacienti monitorováni každých 12 hodin krevní mikroskopií alespoň do 3. dne a déle, pokud je to nutné, až do vymizení parazitů definovaného jako dvě po sobě jdoucí negativní sklíčka.

Při každé návštěvě bude pacient vyslechnut a vyšetřen a bude mu odebrán vzorek krve z píchnutí prstu pro následující výsledky: dvě krevní sklíčka pro pozorování LM (silný a tenký film), 200 μl krve v EDTA/ACD mikronádobce na DNA extrakci a 2 kapky krve do další zkumavky s mikronádobkou obsahující RNAprotect pro extrakci RNA. V den 3 bude odebrána další kapka krve pro měření koncentrace Hb metodou Hemocue.

7., 14., 21., 28., 35., 42. den Pacienti budou dotazováni a vyšetřeni, bude vyplněn kontrolní formulář a zdokumentovány všechny nežádoucí příhody. Vzorek krve z píchnutí prstu bude odebrán pro následující výsledky: dvě krevní sklíčka pro pozorování LM (tlustý a tenký film), 200 μl krve v EDTA/ACD mikrotainerové zkumavce pro extrakci DNA a 2 kapky krve do mikrotainerové zkumavky obsahující RNAprotect .

Kromě toho bude 7. den odebráno 100 μl krve na filtrační papír pro stanovení koncentrace CQ v krvi. Ve dnech 7, 14, 28 a 42 bude měřena koncentrace Hb (Hemocue) z píchnutí do prstu.

Den recidivy P.vivax: Pokud se recidiva potvrdí, bude před podáním záchranné léčby odebrán další vzorek žilní krve. 100 μl této žilní krve se nanese na filtrační papír ke stanovení koncentrace CQ v krvi, zbytek se použije pro test ex vivo a kryokonzervaci, jak je podrobně uvedeno v příloze VI-C.

3.5.4 Ztráta při porušení protokolu sledování Ke ztrátě sledování dochází, když se zapsaný pacient přes veškeré přiměřené úsilí nedostaví na plánované návštěvy a nemůže být nalezen. Těmto pacientům nebude přidělen žádný výsledek léčby. Tito pacienti budou klasifikováni jako ztracení pro sledování a cenzurováni nebo vyloučeni z analýzy.

Pacienti ve studii, kteří splňují kterékoli z následujících kritérií, budou klasifikováni jako odvolaní: i) odvolání souhlasu; ii) nedokončení léčby; iii) závažné nežádoucí příhody vyžadující ukončení léčby před dokončením celé kúry; iv) porušení registrace; v) dobrovolné porušení protokolu; vi) nedobrovolné porušení protokolu

3.5.5 Laboratorní postupy a hodnocení Mikroskopie Při screeningu by měla být získána tři sklíčka (tenké/silné krevní nátěry), z nichž jedno se rychle obarví (10% Giemsa po dobu 10 minut) pro vyšetření v omezeném počtu polí, aby se zajistila přítomnost asexuálních forem P.vivax při minimální parazitémii 250/ul. Jakmile je pacient zařazen, další dvě sklíčka budou obarvena pečlivěji (3% Giemsa po dobu 45 minut). Hustota bude vyjádřena jako počet asexuálních parazitů na µl krve a vypočítá se vydělením počtu asexuálních parazitů počtem spočítaných bílých krvinek a korigovaných odhadovanou hustotou bílých krvinek (typicky 8000 na µl). Je-li počet asexuálních parazitů nižší než 10 na 200 bílých krvinek, provede se počítání proti alespoň 500 bílých krvinek. Krevní sklíčko bude považováno za negativní, když vyšetření 1000 WBC neodhalí žádné asexuální parazity.

• Kruhová parazitémie: Počet prstencových stadií bude počítán ve všech pozitivních preparátech v den 0 a v den recidivy proti 200 asexuálním parazitům; pouze izoláty, u kterých podíl fází kruhu přesahuje 65 %, budou použity pro ex vivo lékový test.
• Gametocyty: hustota bude vypočítána spočítáním počtu gametocytů na 500 WBC.

Hladiny hemoglobinu Hladiny Hb budou měřeny z plné krve odebrané do mikrokyvety pomocí Hemocue podle pokynů výrobce.

Měření koncentrace CQ 7. den a den recidivy ze 100 µl krve vypuzené na chromatografický papír (31ETCHR, Whatman) Molekulární detekce a genotypizace parazitů DNA bude extrahována na ITM/NIMPE ze vzorků krve odebraných z prstu v mikrotainerech. Molekulární potvrzení druhů Plasmodium v ​​den 0 bude provedeno pomocí qPCR zacíleného na 18S ribozomální gen. Stejná metoda qPCR bude použita k identifikaci a kvantifikaci infekcí P. vivax v den 0 a ke sledování vzorků.

Genotypy P. vivax budou identifikovány pomocí PCR amplifikace 3 markerů zvláště účinných pro otisky prstů v klinických studiích (MS16, Pv3.2 a msp1F3) s následnou kapilární gelovou elektroforézou.

Extrakce RNA a RT-qPCR pro gametocyty RNA bude extrahována ze vzorků RNAprotect na ITM/NIMPE pomocí afinitních kolon a štěpení genomové DNA DNAázou. Pro detekci a kvantifikaci stádií gametocytů P. vivax bude provedena reverzní transkripce qPCR (RT-qPCR) zacílená na transkripty genu Pvs25 na D0 a ve všech následných vzorcích.

Laboratorní analýza lékové rezistence (den 0 a recidivy) Krátce, krev bude centrifugována a plazma bude skladována při -20ºC. Horní část buffy coat bude opatrně odstraněna a uložena při -20ºC. Červené krvinky (RBC) budou resuspendovány v PBS (1:1) a leukocyty budou odstraněny pomocí celulózových kolon (Sigma). Filtrované buňky se promyjí a pelet se změří před resuspendováním na 50% hematokrit v McCoyově médiu (směs krevního média, BMM, 4 ml).

Testy citlivosti na léčivo ex vivo: Stručně, destičky s předem nadávkovanými 7bodovými 2-násobnými ředěními CQ, PPQ, DHA a chininu budou připraveny podle postupů WWARN [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Minimální inhibiční koncentrace a IC50 budou vypočteny pomocí nástroje In Vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) vyvinutého online organizací WWARN.

Test nedostatku G6PD: všichni pacienti budou před léčbou PQ testováni na nedostatek G6PD pomocí testu v místě péče od CareStart (Access Bio, New Jersey, USA).

4. Zajištění kvality Monitorovací návštěvy na místě budou naplánovány pravidelně. Během těchto návštěv budou informace zaznamenané na formulářích kazuistik ověřeny se zdrojovými dokumenty. Poté, co jsou formuláře kazuistiky na konci studie shromážděny, budou zkontrolovány z hlediska úplnosti a přesnosti. Data budou dvojitě zanesena do elektronické databáze, kde se používají speciálně navržené počítačové kontroly k identifikaci vybraných porušení protokolu a chyb v datech.

Všechny krevní filmy při přijetí budou odečteny v místě studie a také starším mikroskopem v koordinačním centru. Kromě toho bude v ITM provedena externí kontrola kvality u 10 % náhodně vybraných snímků. Pro každý z molekulárních testů (qPCR, RT-qPCR a genotypizace parazitů) bude náhodně vybráno 10 % vzorků zpracovaných v NIMPE, které budou znovu analyzovány v ITM. Ex vivo kontrola kvality výsledků ex vivo testů léků bude provedena na ITM, kde budou sklíčka znovu vyšetřena na 10 % náhodně vybraných izolátů.

5. Statistický analytický plán Analýza míry vyléčení 42. dne bude provedena jak pro populaci pacientů se záměrem léčit (ITT), tak pro hodnotitelnou populaci pacientů (podle protokolu). Analýza dat bude provedena pomocí softwaru STATA 12. Pro kategorické proměnné budou procenta a odpovídající 95% intervaly spolehlivosti vypočteny podle Wilsonovy metody. Proporce budou porovnány výpočtem *2 s Yatesovou korekcí nebo Fisherovým přesným testem, kde je to vhodné. Normálně rozložená spojitá data budou porovnána Studentovým t testem a analýzou rozptylu. Data neodpovídající normální distribuci budou porovnána Mann-Whitney U testem nebo Kruskal-Wallisovou analýzou rozptylu. Korelace mezi 2 spojitými proměnnými bude podle potřeby posouzena buď pomocí Pearsonova nebo Spearmanova koeficientu pořadové korelace.

Celkové riziko selhání léčby ke dni 28 a ke dni 42 bude vypočteno metodou Kaplan Meier a porovnání mezi rizikovými skupinami bude provedeno pomocí log rank testu. Riziko upravené pro PCR v den 28 a 42 bude také vypočítáno podle výsledků genotypizace každé rekurentní infekce P.vivax. Doba a rychlost odstraňování parazitů budou odhadnuty pomocí online nástroje PCE vyvinutého společností WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). Střední hodnoty IC50 a IC90 pro CQ budou odhadnuty pomocí nástroje In vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) vyvinutého společností WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Hematologické změny budou hodnoceny měřením změn koncentrace Hb mezi 0., 3., 7., 14., 28. a 42. dnem.

6. Etické otázky 6.1 Etické povolení k provedení studie bude získáno od Etického výboru NIMPE v Hanoji a od Etického výboru Univerzity v Antverpách, jakož i od Institucionálního kontrolního výboru při ITM, Anwerpy.

6.2 Proces souhlasu Pacienti budou zařazeni do studie pouze tehdy, pokud oni (nebo rodiče či opatrovníci dětí) dají informovaný souhlas. Žádost o souhlas je k dispozici v angličtině a přeložena do vietnamštiny, aby byla celá přečtena pacientovi, rodiči nebo opatrovníkovi. Budou vysvětleny podrobnosti o studii a jejích přínosech a potenciálních rizicích. Jakmile budou zodpovězeny jakékoli dotazy, bude vyžadován podpis na dokumentu. Je-li pacient negramotný, musí se podepsat gramotný svědek; pokud je to možné, signatář bude vybrán účastníkem a nebude mít žádné spojení s výzkumným týmem.