Evaluatie van de werkzaamheid van chloroquine voor de behandeling van Plasmodium Vivax-infecties in Centraal-Vietnam

3.1 Onderzoeksopzet Dit onderzoek is opgezet als een 42 dagen durend onderzoek naar de werkzaamheid van geneesmiddelen om de klinische en parasitologische respons na behandeling van P.vivax-malaria-infecties te evalueren. Symptomatische patiënten met mono-infecties met P. vivax, die voldoen aan de studiecriteria, zullen worden opgenomen in de studie en worden behandeld met CQ (totale dosis 25 g/kg gedurende 3 dagen). De behandeling wordt direct geobserveerd en de patiënten worden gedurende 42 dagen actief opgevolgd volgens een uitgebreid WHO-protocol. Aan het einde van de follow-upperiode zullen alle patiënten worden behandeld met primaquine volgens de nationale richtlijnen voor radicale genezing van P.vivax-infecties.

3.2 Studielocatie en populatie De studie zal worden uitgevoerd in het district Krong Pa, provincie Gia Lai, waar de incidentie van zowel P.falciparum als P.vivax tot de hoogste van het land behoort. De studie zal plaatsvinden in de gemeente Chu'R Cam, waar het onderzoeksteam zal samenwerken met het lokale gezondheidspersoneel en alle omliggende gemeenten met malariapatiënten.

De lokale bevolking bestaat voornamelijk uit de JaRai-etnische minderheid en de belangrijkste bezigheid bestaat uit slash and burn-landbouw (voornamelijk maïs, maniok en rijst) in bosvelden, samen met seizoenswerk in rubberplantages en kleinschalige productie van goederen voor dagelijks gebruik. levensonderhoud of handel b.v. koffie en cashewnoten. Het klimaat is tropisch met het droge seizoen van november tot april en het regenseizoen van mei tot oktober. Het gebied is heuvelachtig en bebost (secundair bos) en de belangrijkste malariavector is Anopheles dirus.

3.4 Proefpopulatie De doelpopulatie omvat alle met P.vivax geïnfecteerde patiënten (kinderen en volwassenen) die zich spontaan presenteren op het CHC of geïdentificeerd door middel van actieve screening in de gemeenschap.

3.5 Proefprocedures 3.5.1 Screening en werving Alle consulterende patiënten die tijdens de screening aan de basisinschrijvingscriteria voldoen, krijgen een doorlopend screeningsnummer en worden door de arts nader beoordeeld. Zodra de patiënt aan alle inschrijvingscriteria voldoet, zal hij of zij (of een ouder of voogd in het geval van kinderen) om toestemming worden gevraagd om aan het onderzoek deel te nemen. Vervolgens krijgt hij/zij een studienummer (ID=doornummering). Elke persoon die besluit niet deel te nemen aan het onderzoek zal worden onderzocht, behandeld en opgevolgd door het personeel van de gezondheidsinstelling volgens de zorgstandaard die is vastgesteld door het ministerie van Volksgezondheid.

Bij inschrijving (dag 0) wordt de patiënt onderzocht en wordt een gestandaardiseerde vooraf gecodeerde vragenlijst ingevuld. Een veneus bloedmonster zal worden verzameld in steriele vacutainerbuizen die EDTA of zuur-citraat-dextrose (EDTA/ACD) bevatten van alle patiënten bij inschrijving. Bij volwassenen wordt minimaal 5 ml bloed - en maximaal 8 ml - afgenomen en bij kinderen wordt 1 ml/kg tot maximaal 5 ml afgenomen. Er worden twee bloeddruppels toegevoegd aan een buis van 1,5 ml met 500 µl RNAprotect-reagens (Qiagen).

3.5.2 Behandeling Alle patiënten krijgen een volledige behandeling met CQ in een dosis van 25 mg CQ-base per kg lichaamsgewicht (LG), gegeven gedurende 3 dagen en onder direct toezicht. Patiënten zullen gedurende 60 minuten na de behandeling worden geobserveerd op bijwerkingen of braken. Die patiënten die hun medicatie binnen de eerste 30 minuten braken, krijgen een herhaalde volledige dosis; degenen die braken van 30-60 minuten krijgen een halve dosis. Als de patiënt opnieuw braakt, wordt hij of zij teruggetrokken en wordt reddingstherapie aangeboden.

Reddingsmedicatie:

Oraal=CQ (3 dagen, 25 mg/kg) samen met primaquine (0,25 mg/kg/dag gedurende 14 dagen); Intraveneus (IV) = artesunaat (4 mg/kg/dag) gedurende minimaal 24 uur en totdat de patiënt oraal kan innemen. Ga dan door met orale DHA-PPQ gedurende 3 dagen.

Radicale genezing. De behandeling met primaquine wordt uitgesteld tot het einde van de follow-up en gegeven zoals aanbevolen door de nationale richtlijnen, d.w.z. 0,25 mg/kg/dag gedurende 14 dagen aan alle patiënten met een negatieve G6PD-sneltest.

3.5.3 Follow-up Vanaf dag 0 totdat de parasieten zijn verwijderd, worden patiënten elke 12 uur gecontroleerd met bloedmicroscopie, ten minste tot dag 3 en indien nodig langer totdat de parasieten zijn verwijderd, gedefinieerd als twee opeenvolgende negatieve objectglaasjes.

Bij elk bezoek wordt de patiënt geïnterviewd en onderzocht en wordt een bloedmonster via een vingerprik afgenomen voor de volgende resultaten: twee bloedglaasjes voor LM-observatie (dikke en dunne film), 200μl bloed in een EDTA/ACD-microtainerbuis voor DNA extractie en 2 druppels bloed in een ander microtainerbuisje met RNAprotect voor RNA-extractie. Op dag 3 wordt een extra druppel bloed afgenomen om de Hb-concentratie te meten met de Hemocue-methode.

Dag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Patiënten worden geïnterviewd en onderzocht, het follow-upformulier wordt ingevuld en eventuele bijwerkingen worden gedocumenteerd. Er wordt een bloedmonster met een vingerprik afgenomen voor de volgende uitkomsten: twee bloedglaasjes voor LM-observatie (dikke en dunne film), 200μl bloed in een EDTA/ACD-microtainerbuisje voor DNA-extractie en 2 druppels bloed in een RNAprotect-bevattend microtainerbuisje .

Bovendien wordt op dag 7 100 μl bloed afgenomen op filtreerpapier om de CQ-concentratie in het bloed te bepalen. Op dag 7, 14, 28 en 42 wordt de Hb-concentratie (Hemocue) gemeten vanaf de vingerprik.

Dag van recidief van P.vivax: Als recidief wordt bevestigd, zal er nog een veneus bloedmonster worden afgenomen voordat de noodbehandeling wordt toegediend. 100 μl van dit veneuze bloed zal op filtreerpapier worden gedruppeld om de CQ-concentratie in het bloed te bepalen, de rest wordt gebruikt voor ex vivo assay en cryopreservatie zoals beschreven in Bijlage VI-C.

3.5.4 Loss to follow-up protocolschendingen Loss to follow-up treedt op wanneer, ondanks alle redelijke inspanningen, een geregistreerde patiënt de geplande bezoeken niet bijwoont en niet kan worden gevonden. Aan deze patiënten wordt geen behandelingsresultaat toegewezen. Deze patiënten worden geclassificeerd als verloren voor follow-up en gecensureerd of uitgesloten van de analyse.

Studiepatiënten die aan een van de volgende criteria voldoen, worden geclassificeerd als ingetrokken: i) intrekking van toestemming; ii) het niet voltooien van de behandeling; iii) ernstige bijwerkingen die beëindiging van de behandeling noodzakelijk maken voordat de volledige kuur is voltooid; iv) inschrijvingsschending; v) vrijwillige protocolschending; vi) onvrijwillige protocolschending

3.5.5 Laboratoriumprocedures en evaluatie Microscopie Drie objectglaasjes (dunne/dikke bloeduitstrijkjes) moeten worden verkregen bij de screening, waarvan er één snel moet worden gekleurd (10% Giemsa gedurende 10 min) voor onderzoek in een beperkt aantal velden om de aanwezigheid van aseksuele vormen van P.vivax te verzekeren bij een minimale parasitemie van 250/ul. Zodra de patiënt is ingeschreven, zullen de andere twee objectglaasjes zorgvuldiger worden gekleurd (3% Giemsa gedurende 45 min). Dichtheid wordt uitgedrukt als het aantal aseksuele parasieten per µl bloed en wordt berekend door het aantal aseksuele parasieten te delen door het aantal getelde WBC's en gecorrigeerd door de geschatte WBC-dichtheid (typisch 8000 per µl). Wanneer het aantal aseksuele parasieten minder is dan 10 per 200 WBC's, wordt er geteld tegen ten minste 500 WBC's. Een bloedglaasje wordt als negatief beschouwd wanneer onderzoek van 1000 WBC's geen aseksuele parasieten aan het licht brengt.

• Ringstadiumparasitemie: het aantal ringstadia wordt geteld in alle positieve objectglaasjes op dag 0 en op de dag van recidief tegen 200 aseksuele parasieten; alleen isolaten waarvan het aandeel ringstadia groter is dan 65% zullen worden gebruikt voor de ex vivo-geneesmiddeltest.
• Gametocyten: de dichtheid wordt berekend door het aantal gametocyten per 500 WBC's te tellen.

Hemoglobinewaarden Hb-waarden worden gemeten op volbloed verzameld in microcuvette met behulp van Hemocue volgens de instructies van de fabrikant.

Meting van de CQ-concentratie op dag 7 en de dag van recidief van 100 µl bloed uitgestoten op chromatografiepapier (31ETCHR, Whatman) Moleculaire detectie van parasieten en genotypering DNA zal bij het ITG/NIMPE worden geëxtraheerd uit vingerprikbloedmonsters verzameld in microtainers. Moleculaire bevestiging van Plasmodium-soorten op dag 0 zal worden uitgevoerd door qPCR gericht op het 18S-ribosomale gen. Dezelfde qPCR-methode zal worden gebruikt voor het identificeren en kwantificeren van P. vivax-infecties op dag 0 en voor het opvolgen van monsters.

Genotypes van P. vivax zullen worden geïdentificeerd door middel van PCR-amplificatie van 3 markers die bijzonder effectief zijn voor vingerafdrukken in klinische onderzoeken (MS16, Pv3.2 en msp1F3), gevolgd door capillaire gelelektroforese.

RNA-extractie en RT-qPCR voor gametocyten RNA zal worden geëxtraheerd uit RNAprotect-stalen op het ITG/NIMPE met behulp van affiniteitskolommen en DNAse-digestie van genomisch DNA. Om P. vivax-gametocytstadia te detecteren en te kwantificeren, zal een reverse transcriptie qPCR (RT-qPCR) gericht op Pvs25-gentranscripten worden uitgevoerd op D0 en in alle vervolgmonsters.

Geneesmiddelresistentie laboratoriumanalyse (Dag 0 en van recidief) In het kort, bloed wordt gecentrifugeerd en plasma wordt bewaard bij -20ºC. Het bovenste deel van de buffy coat wordt zorgvuldig verwijderd en bewaard bij -20ºC. Rode bloedcellen (RBC's) worden geresuspendeerd in PBS (1:1) en leukocyten worden gedepleteerd met behulp van cellulosekolommen (Sigma). Gefilterde cellen worden gewassen en de pellet wordt gemeten voordat ze opnieuw worden gesuspendeerd bij 50% hematocriet in McCoy-medium (bloedmediummengsel, BMM, 4 ml).

Ex vivo geneesmiddelgevoeligheidstesten: In het kort zullen platen met voorgedoseerde 7-punts 2-voudige verdunningen van CQ, PPQ, DHA en kinine worden bereid volgens WWARN-procedures [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Minimale remmende concentraties en IC50 zullen worden berekend met behulp van de In Vitro Analysis and Reporting Tool (IVART), online ontwikkeld door de WWARN.

G6PD-deficiëntietest: alle patiënten worden vóór de PQ-behandeling getest op G6PD-deficiëntie met behulp van de point-of-care-test door CareStart (Access Bio, New Jersey, VS).

4. Controlebezoeken voor kwaliteitsborging zullen regelmatig worden gepland. Tijdens deze bezoeken wordt de informatie op de formulieren voor het melden van zaken geverifieerd aan de hand van brondocumenten. Nadat de casusrapportformulieren aan het einde van het proces zijn verzameld, worden ze beoordeeld op volledigheid en nauwkeurigheid. De gegevens worden dubbel ingevoerd in een elektronische database, waar speciaal ontworpen computercontroles worden gebruikt om geselecteerde protocolschendingen en gegevensfouten te identificeren.

Alle bloedfilmpjes bij opname worden zowel op de onderzoekslocatie als door een senior microscopist in een coördinerend centrum gelezen. Daarnaast zal er bij het ITG een externe kwaliteitscontrole gebeuren op 10% van de willekeurig geselecteerde dia's. Voor elk van de moleculaire testen (qPCR, RT-qPCR en genotypering van parasieten) zal 10% van de stalen die bij het NIMPE worden verwerkt willekeurig worden gekozen om opnieuw te worden geanalyseerd in het ITG. Externe kwaliteitscontrole van ex vivo drug assay resultaten zal gebeuren op het ITG waar de objectglaasjes opnieuw onderzocht zullen worden op 10% van de willekeurig gekozen isolaten.

5. Statistisch analyseplan De analyse van het genezingspercentage op dag 42 zal worden uitgevoerd voor zowel de intention-to-treat (ITT) patiëntenpopulatie als de evalueerbare patiëntenpopulatie (per protocol). Gegevensanalyses zullen worden uitgevoerd met behulp van STATA 12-software. Voor categorische variabelen worden percentages en bijbehorende 95% betrouwbaarheidsintervallen berekend volgens de methode van Wilson. Verhoudingen worden vergeleken door de *2 te berekenen met Yates' correctie of waar nodig met Fisher's exact test. Normaal verdeelde continue gegevens worden vergeleken met Student's t-test en variantieanalyse. Gegevens die niet in overeenstemming zijn met een normale verdeling zullen worden vergeleken met de Mann-Whitney U-test of de Kruskal-Wallis-variantieanalyse. De correlatie tussen 2 continue variabelen wordt beoordeeld met behulp van de Pearson- of Spearman's rangcorrelatiecoëfficiënt, zoals vereist.

Het algehele risico op falen van de behandeling op dag 28 en op dag 42 wordt berekend met de Kaplan Meier-methode en er worden vergelijkingen tussen risicogroepen gemaakt met behulp van de log-ranktest. Het voor PCR gecorrigeerde risico op dag 28 en 42 zal ook worden berekend op basis van de genotyperingsresultaten van elke recidiverende P.vivax-infectie. Tijd en snelheid van het opruimen van parasieten worden geschat met behulp van de online tool PCE die is ontwikkeld door WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). De gemiddelde IC50 en IC90 voor CQ zullen worden geschat met behulp van de In vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) ontwikkeld door WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Hematologische veranderingen zullen worden geëvalueerd door de veranderingen in Hb-concentratie te meten tussen respectievelijk dag 0, 3, 7, 14, 28 en 42.

6. Ethische kwesties 6.1 Ethische goedkeuring om de studie uit te voeren zal zijn verkregen van de Ethische Commissie van het NIMPE, Hanoi en van de Ethische Commissie van de Universiteit Antwerpen, evenals van de Institutional Review Board van het ITG, Antwerpen.

6.2 Toestemmingsprocedure Patiënten worden alleen in het onderzoek opgenomen als zij (of ouders of voogden van kinderen) geïnformeerde toestemming geven. Het toestemmingsverzoek is beschikbaar in het Engels en vertaald in het Vietnamees om volledig voor te lezen aan de patiënt, ouder of voogd. Details over de proef en de voordelen en mogelijke risico's zullen worden uitgelegd. Na beantwoording van eventuele vragen wordt gevraagd om een ​​handtekening op het document. Als de patiënt analfabeet is, moet een geletterde getuige tekenen; indien mogelijk wordt de ondertekenaar geselecteerd door de deelnemer en heeft deze geen band met het onderzoeksteam.