Evaluering av effekten av klorokin for behandling av Plasmodium Vivax-infeksjoner i Sentral-Vietnam

3.1 Studiedesign Denne studien er designet som en 42-dagers medikamenteffektivitetsstudie for å evaluere kliniske og parasittologiske responser etter behandling av P.vivax malariainfeksjoner. Symptomatiske pasienter med P. vivax mono-infeksjoner, som oppfyller studiekriteriene, vil bli registrert i studien og behandlet med CQ (total dose 25gm/kg over 3 dager). Behandlingen vil bli direkte observert og pasientene vil bli aktivt fulgt opp i 42 dager i henhold til en utvidet WHO-protokoll. Ved slutten av oppfølgingstiden vil alle pasienter bli behandlet med primakin i henhold til nasjonale retningslinjer for radikal kurering av P.vivax-infeksjoner.

3.2 Studiested og populasjon Studien vil bli utført i Krong Pa-distriktet, Gia Lai-provinsen, hvor både P.falciparum og P.vivax malariaforekomst er blant de høyeste i landet. Studien vil bli lokalisert i Chu'R Cam kommune hvor studieteamet vil jobbe med det lokale helsepersonellet og alle omkringliggende kommuner med malariapasienter.

Lokalbefolkningen består hovedsakelig av den etniske minoriteten JaRai, og hovedbeskjeftigelsen består av slash and burn jordbruk (hovedsakelig mais, maniok og ris) i skogsfelt, sammen med sesongarbeid i gummiplantasjer, og småskala produksjon av varer til daglig. livsopphold eller handel f.eks. kaffe og cashewnøtter. Klimaet er tropisk med tørrsesongen fra november til april og regntiden fra mai til oktober. Området er kupert og skogkledd (sekundærskog) og den viktigste malariavektoren er Anopheles dirus.

3.4 Forsøkspopulasjon Målpopulasjonen inkluderer alle P.vivax-infiserte pasienter (barn og voksne) som enten presenterer seg spontant ved CHC eller identifisert gjennom aktiv screening i samfunnet.

3.5 Utprøvingsprosedyrer 3.5.1 Screening og rekruttering Alle konsulterende pasienter som oppfyller de grunnleggende innmeldingskriteriene under screening vil bli tildelt et fortløpende screeningnummer og evaluert i større dybde av legen. Når pasienten oppfyller alle påmeldingskriteriene, vil han eller hun (eller en forelder eller verge når det gjelder barn) bli bedt om samtykke til å delta i studien. Deretter vil han/hun bli tildelt et studienummer (ID=sekvensnummerering). Enhver som bestemmer seg for ikke å delta i studien vil bli undersøkt, behandlet og fulgt opp av helsepersonell i henhold til den omsorgsstandard som er fastsatt av Helsedepartementet.

Ved innskrivning (dag 0) vil pasienten bli og undersøke og et standardisert forhåndskodet spørreskjema fylles ut. En venøs blodprøve vil bli samlet inn i sterile vacutainer-rør som inneholder EDTA eller syre-sitrat-dekstrose (EDTA/ACD) fra alle pasienter ved registrering. Minimum 5 ml blod - og maksimalt 8 ml - vil bli samlet inn fra voksne, og 1 ml/kg opptil 5 ml vil bli samlet inn fra barn. To bloddråper tilsettes i et 1,5 ml rør som inneholder 500 µL RNAprotect-reagens (Qiagen).

3.5.2 Behandling Alle pasienter vil få en full behandling med CQ i en dose på 25 mg CQ base per kg kroppsvekt (bw) gitt over 3 dager og under direkte tilsyn. Pasienter vil bli observert i 60 minutter etter behandling for bivirkninger eller oppkast. De pasientene som kaster opp medisinen innen de første 30 minuttene vil få en gjentatt full dose; de som kaster opp fra 30-60 minutter vil få halv dose. Hvis pasienten kaster opp igjen, vil han eller hun bli trukket tilbake og tilbudt redningsterapi.

Redningsmedisin:

Oral=CQ (3 dager, 25 mg/kg) sammen med primakin (0,25 mg/kg/dag i 14 dager); Intravenøs (IV)= Artesunate (4mg/kg/dag) i minimum 24 timer og til pasienten er i stand til å ta oralt legemiddel. Fortsett deretter med oral DHA-PPQ i 3 dager.

Radikal kur. Primakinbehandling vil bli forsinket til slutten av oppfølgingen, og gitt som anbefalt av de nasjonale retningslinjene, dvs. 0,25 mg/kg/dag i 14 dager til alle pasienter med negativ G6PD-hurtigtest.

3.5.3 Oppfølging Fra dag 0 til parasittclearance vil pasienter overvåkes hver 12. time ved blodmikroskopi minst til dag 3 og lenger om nødvendig inntil parasittclearance definert som to påfølgende negative lysbilder.

Ved hvert besøk vil pasienten bli intervjuet og undersøkt, og det vil bli tatt en fingerstikkblodprøve for følgende utfall: to blodglass for LM-observasjon (tykk og tynn film), 200 μl blod i et EDTA/ACD-mikrotainerrør for DNA ekstraksjon, og 2 dråper blod inn i et annet mikrotainerrør som inneholder RNAprotect for RNA-ekstraksjon. På dag 3 vil det bli tatt en ekstra dråpe blod for å måle Hb-konsentrasjonen med Hemocue-metoden.

Dag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Pasientene vil bli intervjuet og undersøkt, oppfølgingsskjemaet fylles ut og eventuelle uønskede hendelser dokumenteres. En blodprøve med fingerstikk vil bli samlet inn for følgende utfall: to blodglass for LM-observasjon (tykk og tynn film), 200 μl blod i et EDTA/ACD-mikrotainerrør for DNA-ekstraksjon, og 2 dråper blod i RNAprotect-inneholdende mikrotainerrør .

I tillegg, på dag 7, vil 100 μl blod bli tatt på filterpapir for å bestemme blodets CQ-konsentrasjon. På dag 7, 14, 28 og 42 vil Hb-konsentrasjonen (Hemocue) bli målt fra fingerstikk.

Dag for P.vivax-residiv: Hvis residiv bekreftes, vil en ytterligere venøs blodprøve bli tatt før administrasjon av redningsbehandling. 100 μl av dette venøse blodet vil bli flekket på filterpapir for å bestemme blodets CQ-konsentrasjon, resten brukes til ex vivo-analyse og kryokonservering som beskrevet i vedlegg VI-C.

3.5.4 Tap ved brudd på oppfølgingsprotokollen Tap til oppfølging oppstår når, til tross for alle rimelige anstrengelser, en registrert pasient ikke deltar på de planlagte besøkene og ikke kan bli funnet. Ingen behandlingsresultater vil bli tildelt disse pasientene. Disse pasientene vil bli klassifisert som tapt for oppfølging og sensurert eller ekskludert fra analysen.

Studiepasienter som oppfyller noen av følgende kriterier vil bli klassifisert som trukket tilbake: i) tilbaketrekking av samtykke; ii) manglende fullføring av behandlingen; iii) alvorlige uønskede hendelser som gjør det nødvendig å avslutte behandlingen før hele kurset er fullført; iv) brudd på registreringen; v) frivillig brudd på protokollen; vi) ufrivillig brudd på protokollen

3.5.5 Laboratorieprosedyrer og evaluering Mikroskopi Tre objektglass (tynne/tykke blodutstryk) bør oppnås ved screening, hvorav det ene farges raskt (10 % Giemsa i 10 minutter) for undersøkelse i et begrenset antall felt for å sikre tilstedeværelsen av P.vivax aseksuelle former ved et minimum parasitemi på 250/ul. Når pasienten er registrert, vil de to andre objektglassene farges mer forsiktig (3 % Giemsa i 45 minutter). Tetthet, vil bli uttrykt som antall aseksuelle parasitter per µl blod, og beregnet ved å dele antall aseksuelle parasitter med antall WBC-er som telles og korrigeres med den estimerte WBC-tettheten (typisk 8000 per µl). Når antallet aseksuelle parasitter er mindre enn 10 per 200 WBCs, vil tellingen gjøres mot minst 500 WBCs. Et blodskred vil bli ansett som negativt når undersøkelse av 1000 WBC ikke avslører aseksuelle parasitter.

• Ringstadiumparasitemi: Antall ringstadier vil telles i alle positive lysbilder på dag 0 og på tilbakefallsdagen mot 200 aseksuelle parasitter; kun isolater hvor andelen ringstadier overstiger 65 % vil bli brukt for ex vivo-medisinanalysen.
• Gametocytter: tetthet vil bli beregnet ved å telle antall gametocytter per 500 WBC.

Hemoglobinnivåer Hb-nivåer vil bli målt på fullblod samlet inn i mikrokyvette ved hjelp av Hemocue etter produsentens instruksjoner.

Måling av CQ-konsentrasjon på dag 7 og dag for tilbakefall fra 100 µl blod utvist på kromatografipapir (31ETCHR, Whatman) Parasittmolekylær deteksjon og genotyping-DNA vil bli ekstrahert ved ITM/NIMPE fra blodprøver med fingerstikk samlet inn i mikrotainere. Molekylær bekreftelse av Plasmodium-arter på dag 0 vil bli utført med qPCR rettet mot 18S ribosomalt gen. Den samme qPCR-metoden vil bli brukt til å identifisere og kvantifisere P. vivax-infeksjoner på dag 0 og følge opp prøver.

P. vivax-genotyper vil bli identifisert gjennom PCR-amplifisering av 3 markører som er spesielt effektive for fingeravtrykk i kliniske studier (MS16, Pv3.2 og msp1F3) etterfulgt av kapillærgelelektroforese.

RNA-ekstraksjon og RT-qPCR for gametocytter RNA vil bli ekstrahert fra RNAprotect-prøver ved ITM/NIMPE ved bruk av affinitetskolonner og DNAse-fordøyelse av genomisk DNA. For å oppdage og kvantifisere P. vivax gametocyttstadier vil en revers transkripsjon qPCR (RT-qPCR) rettet mot Pvs25-gentranskripsjoner bli gjort på D0 og i alle oppfølgingsprøver.

Medikamentresistens laboratorieanalyse (dag 0 og ved tilbakefall) Kort fortalt vil blod sentrifugeres og plasma lagres ved -20ºC. Den øvre delen av buffy coat fjernes forsiktig og lagres ved -20ºC. Røde blodlegemer (RBC) vil bli resuspendert i PBS (1:1) og leukocytter vil bli utarmet ved hjelp av cellulosekolonner (Sigma). Filtrerte celler vil bli vasket og pellets målt før resuspendering ved 50 % hematokritt i McCoy-medium (blodmediumblanding, BMM, 4 ml).

Ex vivo legemiddelsensitivitetsanalyser: Kort fortalt, plater med forhåndsdoserte 7-punkts 2-gangers fortynninger av CQ, PPQ, DHA og kinin vil bli klargjort etter WWARN-prosedyrer [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Minimale hemmende konsentrasjoner og IC50 vil bli beregnet ved hjelp av In Vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) utviklet online av WWARN.

G6PD-mangeltest: alle pasienter vil bli testet for G6PD-mangel ved å bruke point-of-care-testen fra CareStart (Access Bio, New Jersey, USA) før PQ-behandling.

4. Kvalitetssikring Stedovervåkingsbesøk vil bli planlagt regelmessig. Under disse besøkene vil informasjon registrert på saksrapportskjemaene bli verifisert mot kildedokumenter. Etter at saksrapportskjemaene er samlet på slutten av rettssaken, vil de bli gjennomgått for fullstendighet og nøyaktighet. Dataene vil bli dobbeltinnført i en elektronisk database, hvor spesialdesignede datasjekker brukes for å identifisere utvalgte protokollbrudd og datafeil.

Alle blodfilmer ved innleggelse vil bli lest på studiestedet samt av en seniormikroskopist ved et koordinerende senter. I tillegg vil det bli gjort en ekstern kvalitetskontroll på ITM på 10 % av tilfeldig valgte lysbilder. For hver av de molekylære analysene (qPCR, RT-qPCR og parasittgenotyping) vil 10 % av prøvene behandlet ved NIMPE bli tilfeldig valgt for å bli analysert på nytt ved ITM. Ekstern kvalitetskontroll av ex vivo medisinanalyseresultater vil bli utført ved ITM hvor objektglassene vil bli undersøkt på nytt for 10 % av tilfeldig valgte isolater.

5. Statistisk analytisk plan Analysen av kurraten på dag 42 vil bli utført både for intention-to-treat (ITT) pasientpopulasjonen og den evaluerbare pasientpopulasjonen (Per Protocol). Dataanalyser vil bli utført med STATA 12 programvare. For kategoriske variabler vil prosenter og tilsvarende 95 % konfidensintervaller bli beregnet etter Wilsons metode. Proporsjoner vil bli sammenlignet ved å beregne *2 med Yates' korreksjon eller ved Fishers eksakte test der det er aktuelt. Normalfordelte kontinuerlige data vil bli sammenlignet med Students t-test og variansanalyse. Data som ikke samsvarer med en normalfordeling vil bli sammenlignet med Mann-Whitney U-testen eller Kruskal-Wallis variansanalyse. Korrelasjonen mellom 2 kontinuerlige variabler vil bli vurdert ved å bruke enten Pearson eller Spearmans rangkorrelasjonskoeffisient etter behov.

Den totale risikoen for behandlingssvikt innen dag 28 og dag 42 vil bli beregnet ved hjelp av Kaplan Meier-metoden, og sammenligninger mellom risikogrupper vil bli gjort ved hjelp av log rank test. Den PCR-justerte risikoen på dag 28 og 42 vil også bli beregnet etter genotypingsresultatene for hver tilbakevendende P.vivax-infeksjon. Parasittklareringstid og -hastighet vil bli estimert ved hjelp av PCE-nettverket utviklet av WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). Gjennomsnittlig IC50 og IC90 for CQ vil bli estimert ved å bruke verktøyet In vitro analyse og rapportering (IVART) utviklet av WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Hematologiske endringer vil bli evaluert ved å måle endringene i Hb-konsentrasjon mellom henholdsvis dag0, 3, 7, 14, 28 og 42.

6. Etiske problemstillinger 6.1 Etisk godkjenning for å gjennomføre studien vil ha blitt innhentet fra etikkkomiteen i NIMPE, Hanoi og fra etikkkomiteen ved universitetet i Antwerpen, samt fra Institusjonsvurderingsutvalget ved ITM, Anwerp.

6.2 Samtykkeprosess Pasienter vil bli inkludert i studien bare hvis de (eller foreldre eller foresatte til barn) gir informert samtykke. Samtykkeforespørselen er tilgjengelig på engelsk og oversatt til vietnamesisk for å leses i sin helhet for pasienten, forelderen eller foresatt. Detaljer om prøven og dens fordeler og potensielle risikoer vil bli forklart. Når eventuelle spørsmål er besvart, vil det bli bedt om en signatur på dokumentet. Hvis pasienten er analfabet, må et lesekyndig vitne skrive under; om mulig vil underskriveren velges av deltakeren og vil ikke ha noen tilknytning til forskerteamet.