Ocena skuteczności chlorochiny w leczeniu zakażeń Plasmodium Vivax w środkowym Wietnamie

3.1 Projekt badania To badanie zostało zaprojektowane jako 42-dniowe badanie skuteczności leku w celu oceny odpowiedzi klinicznych i parazytologicznych po leczeniu zakażeń malarią P.vivax. Objawowi pacjenci z monoinfekcją P. vivax, spełniający kryteria badania, zostaną włączeni do badania i leczeni CQ (całkowita dawka 25 gm/kg przez 3 dni). Leczenie będzie bezpośrednio obserwowane, a pacjenci będą aktywnie obserwowani przez 42 dni zgodnie z rozszerzonym protokołem WHO. Pod koniec okresu obserwacji wszyscy pacjenci będą leczeni prymachiną zgodnie z krajowymi wytycznymi dotyczącymi radykalnego leczenia zakażeń P. vivax.

3.2 Miejsce badania i populacja Badanie zostanie przeprowadzone w dystrykcie Krong Pa w prowincji Gia Lai, gdzie częstość występowania malarii P. falciparum i P. vivax należy do najwyższych w kraju. Badanie będzie zlokalizowane w gminie Chu'R Cam, gdzie zespół badawczy będzie współpracował z lokalnym personelem medycznym i wszystkimi okolicznymi gminami, w których występują chorzy na malarię.

Miejscowa ludność składa się głównie z mniejszości etnicznej JaRai, a głównym zajęciem jest uprawa roli typu slash and burn (głównie kukurydza, maniok i ryż) na polach leśnych, a także praca sezonowa na plantacjach kauczuku oraz produkcja na małą skalę towarów codziennego użytku utrzymanie lub handel, np. kawa i orzechy nerkowca. Klimat jest tropikalny z porą suchą od listopada do kwietnia i porą deszczową od maja do października. Obszar ten jest pagórkowaty i zalesiony (lasy wtórne), a głównym nosicielem malarii jest Anopheles dirus.

3.4 Populacja badana Populacja docelowa obejmuje wszystkich pacjentów zakażonych P. vivax (dzieci i dorosłych) zgłaszających się spontanicznie w PZWZ lub zidentyfikowanych poprzez aktywne badania przesiewowe w społeczności.

3.5 Procedury badania 3.5.1 Badanie przesiewowe i rekrutacja Wszyscy konsultowani pacjenci, którzy spełniają podstawowe kryteria kwalifikacji podczas badania przesiewowego, otrzymają kolejny numer badania przesiewowego i zostaną dokładniej ocenieni przez lekarza. Po spełnieniu przez pacjenta wszystkich kryteriów włączenia, on (lub rodzic lub opiekun w przypadku dzieci) zostanie poproszony o wyrażenie zgody na udział w badaniu. Następnie zostanie mu nadany numer badania (ID=numeracja sekwencyjna). Każda osoba, która nie zdecyduje się na udział w badaniu, zostanie przebadana, leczona i objęta opieką przez personel placówki zgodnie ze standardami opieki określonymi przez Ministerstwo Zdrowia.

Podczas rejestracji (Dzień 0) pacjent zostanie poddany badaniu i wypełnieniu standardowego wstępnie zakodowanego kwestionariusza. Próbka krwi żylnej zostanie pobrana do sterylnych probówek Vacutainer zawierających EDTA lub kwaśno-cytrynianowo-dekstrozową (EDTA/ACD) od wszystkich pacjentów podczas rekrutacji. Od dorosłych zostanie pobrane co najmniej 5 ml krwi, a maksymalnie 8 ml, a od dzieci 1 ml/kg do 5 ml. Dwie krople krwi zostaną dodane do 1,5 ml probówki zawierającej 500 µl odczynnika RNAprotect (Qiagen).

3.5.2 Leczenie Wszyscy pacjenci otrzymają pełne leczenie CQ w dawce 25 mg zasady CQ na kg masy ciała (m.c.) podawane przez 3 dni i pod bezpośrednim nadzorem. Pacjenci będą obserwowani przez 60 minut po leczeniu pod kątem działań niepożądanych lub wymiotów. Pacjenci wymiotujący lekiem w ciągu pierwszych 30 minut otrzymają powtórną pełną dawkę; osoby wymiotujące od 30 do 60 minut otrzymają połowę dawki. Jeśli pacjent ponownie wymiotuje, zostanie wycofany i zaoferowana terapia ratunkowa.

Lek ratunkowy:

Doustnie = CQ (3 dni, 25 mg/kg) razem z prymachiną (0,25 mg/kg/dzień przez 14 dni); Dożylnie (IV) = Artesunat (4mg/kg/dobę) przez minimum 24h i do czasu, aż pacjent będzie mógł przyjmować lek doustnie. Następnie kontynuuj doustne podawanie DHA-PPQ przez 3 dni.

Radykalne lekarstwo. leczenie prymachiną będzie opóźnione do końca okresu obserwacji i podawane zgodnie z zaleceniami krajowych wytycznych, tj. 0,25 mg/kg/dobę przez 14 dni wszystkim pacjentom z ujemnym szybkim testem G6PD.

3.5.3 Obserwacja Od dnia 0 do usunięcia pasożytów pacjenci będą monitorowani co 12 godzin za pomocą mikroskopii krwi przynajmniej do dnia 3 i dłużej, jeśli to konieczne, aż do usunięcia pasożytów zdefiniowanego jako dwa kolejne szkiełka negatywne.

Podczas każdej wizyty pacjent będzie przesłuchiwany i badany oraz pobierana będzie próbka krwi z palca w celu uzyskania następujących wyników: dwa preparaty krwi do obserwacji LM (gruby i cienki film), 200 μl krwi w probówce mikrotainerowej EDTA/ACD do oznaczania DNA ekstrakcji i 2 krople krwi do innej probówki microtainer zawierającej RNAprotect do ekstrakcji RNA. W dniu 3 zostanie pobrana dodatkowa kropla krwi w celu zmierzenia stężenia Hb metodą Hemocue.

Dzień 7, 14, 21, 28, 35, 42 Pacjenci zostaną przesłuchani i zbadani, wypełniony zostanie formularz kontrolny, a wszelkie zdarzenia niepożądane zostaną udokumentowane. Próbka krwi z nakłucia palca zostanie pobrana w celu uzyskania następujących wyników: dwa preparaty krwi do obserwacji LM (gruby i cienki film), 200 μl krwi w probówce microtainer EDTA/ACD do ekstrakcji DNA oraz 2 krople krwi w probówce microtainer zawierającej RNAprotect .

Ponadto, w dniu 7, 100 μl krwi zostanie pobrane na bibułę filtracyjną w celu określenia stężenia CQ we krwi. W dniach 7, 14, 28 i 42 stężenie Hb (Hemocue) będzie mierzone z palca.

Dzień nawrotu P.vivax: Jeśli nawrót zostanie potwierdzony, przed podaniem leczenia ratunkowego zostanie pobrana kolejna próbka krwi żylnej. 100 μl tej krwi żylnej zostanie naniesione na bibułę filtracyjną w celu określenia stężenia CQ we krwi, a pozostała część zostanie wykorzystana do testu ex vivo i kriokonserwacji, jak wyszczególniono w załączniku VI-C.

3.5.4 Utrata naruszeń protokołu obserwacji Utrata kontroli ma miejsce, gdy pomimo wszelkich uzasadnionych wysiłków zapisany pacjent nie przychodzi na zaplanowane wizyty i nie można go znaleźć. Takim pacjentom nie zostanie przypisany żaden wynik leczenia. Pacjenci ci zostaną sklasyfikowani jako utraconi z obserwacji i ocenzurowani lub wykluczeni z analizy.

Badani pacjenci, którzy spełniają którekolwiek z poniższych kryteriów, zostaną sklasyfikowani jako wycofani: i) wycofanie zgody; ii) nieukończenie leczenia; iii) poważne zdarzenia niepożądane wymagające przerwania leczenia przed zakończeniem pełnego cyklu; iv) naruszenie zasad rejestracji; v) dobrowolne naruszenie protokołu; vi) mimowolne naruszenie protokołu

3.5.5 Procedury laboratoryjne i ocena Mikroskopia Podczas badania przesiewowego należy pobrać trzy preparaty (cienkie/grube rozmazy krwi), z których jedno należy szybko wybarwić (10% Giemsa przez 10 min) do zbadania na ograniczonej liczbie pól, aby upewnić się, że występują bezpłciowe formy P. vivax przy minimalnej parazytemii 250/ul. Po wpisaniu pacjenta pozostałe dwa szkiełka zostaną dokładniej wybarwione (3% Giemsa przez 45 min). Gęstość zostanie wyrażona jako liczba pasożytów bezpłciowych na µl krwi i obliczona poprzez podzielenie liczby pasożytów bezpłciowych przez liczbę zliczonych WBC i skorygowanych o szacunkową gęstość WBC (zwykle 8000 na µl). Gdy liczba pasożytów bezpłciowych jest mniejsza niż 10 na 200 białych krwinek, liczenie zostanie przeprowadzone na podstawie co najmniej 500 białych krwinek. Preparat krwi zostanie uznany za ujemny, gdy badanie 1000 białych krwinek nie wykaże obecności pasożytów bezpłciowych.

• Parazytemia w stadium pierścienia: liczba stadiów pierścienia zostanie policzona na wszystkich pozytywnych preparatach w dniu 0 iw dniu nawrotu wobec 200 pasożytów bezpłciowych; tylko izolaty, w przypadku których odsetek stadiów pierścieniowych przekracza 65%, zostaną użyte do oznaczenia leku ex vivo.
• Gametocyty: gęstość zostanie obliczona przez zliczenie liczby gametocytów na 500 białych krwinek.

Poziomy hemoglobiny Poziomy Hb będą mierzone w pełnej krwi pobranej do mikrokuwety przy użyciu Hemocue zgodnie z instrukcjami producenta.

Pomiar stężenia CQ w dniu 7 i dniu nawrotu ze 100 µl krwi wyrzuconej na bibułę chromatograficzną (31ETCHR, Whatman) Wykrywanie molekularne pasożyta i genotypowanie DNA zostanie wyekstrahowane w ITM/NIMPE z próbek krwi pobranych z palca pobranych do mikrotainerów. Molekularne potwierdzenie gatunków Plasmodium w dniu 0 zostanie przeprowadzone przez qPCR ukierunkowany na gen rybosomalny 18S. Ta sama metoda qPCR zostanie wykorzystana do identyfikacji i ilościowego określenia infekcji P. vivax w dniu 0 i dalszych próbek.

Genotypy P. vivax zostaną zidentyfikowane poprzez amplifikację PCR 3 markerów szczególnie skutecznych do pobierania odcisków palców w badaniach klinicznych (MS16, Pv3.2 i msp1F3), a następnie elektroforezę w żelu kapilarnym.

Ekstrakcja RNA i RT-qPCR dla gametocytów RNA zostanie wyekstrahowane z próbek RNAprotect w ITM/NIMPE przy użyciu kolumn powinowactwa i trawienia genomowego DNA DNAzą. Aby wykryć i określić ilościowo etapy gametocytów P. vivax, w D0 i we wszystkich kolejnych próbkach zostanie przeprowadzona metoda odwrotnej transkrypcji qPCR (RT-qPCR) ukierunkowana na transkrypty genu Pvs25.

Analiza laboratoryjna lekooporności (dzień 0 i nawrót) W skrócie, krew zostanie odwirowana, a osocze będzie przechowywane w temperaturze -20ºC. Górna część kożuszka zostanie ostrożnie zdjęta i przechowywana w temperaturze -20ºC. Krwinki czerwone (RBC) zostaną ponownie zawieszone w PBS (1:1), a leukocyty zostaną zubożone przy użyciu kolumn celulozowych (Sigma). Przefiltrowane komórki zostaną przemyte i zmierzony osad przed ponownym zawieszeniem przy 50% hematokrycie w pożywce McCoy (mieszanina pożywki z krwią, BMM, 4 ml).

Testy wrażliwości na leki ex vivo: Pokrótce, płytki z wstępnie dozowanymi 7-punktowymi 2-krotnymi rozcieńczeniami CQ, PPQ, DHA i chininy zostaną przygotowane zgodnie z procedurami WWARN [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Minimalne stężenia hamujące i IC50 zostaną obliczone przy użyciu narzędzia do analizy i raportowania in vitro (IVART) opracowanego online przez WWARN.

Test niedoboru G6PD: wszyscy pacjenci zostaną przebadani pod kątem niedoboru G6PD za pomocą testu przyłóżkowego firmy CareStart (Access Bio, New Jersey, USA) przed rozpoczęciem leczenia PQ.

4. Zapewnienie jakości Wizyty monitorujące witrynę będą planowane w regularnych odstępach czasu. Podczas tych wizytacji informacje zapisane na kartach opisów przypadków będą weryfikowane z dokumentami źródłowymi. Po zestawieniu formularzy opisów przypadków pod koniec badania zostaną one sprawdzone pod kątem kompletności i dokładności. Dane będą dwukrotnie wprowadzane do elektronicznej bazy danych, w której specjalnie zaprojektowane kontrole komputerowe służą do identyfikacji wybranych naruszeń protokołów i błędów danych.

Wszystkie rozmazy krwi przy przyjęciu zostaną odczytane w miejscu badania, jak również przez starszego mikroskopistę w ośrodku koordynującym. Ponadto w ITM zostanie przeprowadzona zewnętrzna kontrola jakości na 10% losowo wybranych slajdów. Dla każdego z testów molekularnych (qPCR, RT-qPCR i genotypowanie pasożytów) 10% próbek przetwarzanych w NIMPE zostanie losowo wybranych do ponownej analizy w ITM. Zewnętrzna kontrola jakości wyników testów na obecność narkotyków ex vivo zostanie przeprowadzona w ITM, gdzie preparaty zostaną ponownie zbadane pod kątem 10% losowo wybranych izolatów.

5. Statystyczny plan analityczny Analiza odsetka wyleczeń w dniu 42 zostanie przeprowadzona zarówno dla populacji pacjentów, którzy mają zamiar leczyć (ITT), jak i populacji pacjentów podlegających ocenie (zgodnie z protokołem). Analizy danych zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania STATA 12. Dla zmiennych kategorialnych procenty i odpowiadające im 95% przedziały ufności zostaną obliczone metodą Wilsona. Proporcje zostaną porównane poprzez obliczenie *2 z poprawką Yatesa lub dokładnym testem Fishera, gdzie to właściwe. Dane ciągłe o rozkładzie normalnym zostaną porównane za pomocą testu t-Studenta i analizy wariancji. Dane niezgodne z rozkładem normalnym zostaną porównane za pomocą testu U Manna-Whitneya lub analizy wariancji Kruskala-Wallisa. Korelacja między 2 zmiennymi ciągłymi zostanie oceniona przy użyciu współczynnika korelacji rang Pearsona lub Spearmana, zgodnie z wymaganiami.

Całkowite ryzyko niepowodzenia leczenia do dnia 28. i do dnia 42. zostanie obliczone metodą Kaplana-Meiera, a porównania między grupami ryzyka zostaną przeprowadzone przy użyciu testu log-rank. Skorygowane PCR ryzyko w dniu 28 i 42 zostanie również obliczone na podstawie wyników genotypowania każdej nawracającej infekcji P. vivax. Czas i tempo eliminacji pasożytów zostaną oszacowane za pomocą internetowego narzędzia PCE opracowanego przez WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). Średnie IC50 i IC90 dla CQ zostaną oszacowane przy użyciu narzędzia do analizy i raportowania in vitro (IVART) opracowanego przez WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Zmiany hematologiczne będą oceniane przez pomiar zmian stężenia Hb między, odpowiednio, dniami 0, 3, 7, 14, 28 i 42.

6. Kwestie etyczne 6.1 Zgoda etyczna na przeprowadzenie badania zostanie uzyskana od Komisji ds. Etyki NIMPE w Hanoi oraz od Komisji ds. Etyki Uniwersytetu w Antwerpii, a także od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej przy ITM w Anwerp.

6.2 Proces uzyskiwania zgody Pacjenci zostaną włączeni do badania tylko wtedy, gdy oni (lub rodzice lub opiekunowie dzieci) wyrażą świadomą zgodę. Prośba o zgodę jest dostępna w języku angielskim i przetłumaczona na język wietnamski, aby można ją było przeczytać w całości pacjentowi, rodzicowi lub opiekunowi. Zostaną wyjaśnione szczegóły dotyczące badania oraz jego korzyści i potencjalnego ryzyka. Po udzieleniu odpowiedzi na wszelkie pytania, dokument zostanie poproszony o podpis. Jeśli pacjent jest analfabetą, świadek musi podpisać pismo; jeśli to możliwe, sygnatariusz zostanie wybrany przez uczestnika i nie będzie miał powiązań z zespołem badawczym.