Avaliando a eficácia da cloroquina para o tratamento de infecções por Plasmodium vivax no Vietnã Central

3.1 Desenho do estudo Este estudo foi concebido como um estudo de eficácia de medicamentos de 42 dias para avaliar as respostas clínicas e parasitológicas após o tratamento de infecções por malária P.vivax. Pacientes sintomáticos com monoinfecções por P. vivax, que atendam aos critérios do estudo, serão incluídos no estudo e tratados com CQ (dose total de 25 gm/kg durante 3 dias). O tratamento será observado diretamente e os pacientes serão acompanhados ativamente por 42 dias de acordo com um protocolo estendido da OMS. Ao final do tempo de acompanhamento, todos os pacientes serão tratados com primaquina seguindo as diretrizes nacionais para a cura radical de infecções por P.vivax.

3.2 Local do estudo e população O estudo será realizado no distrito de Krong Pa, província de Gia Lai, onde a incidência de malária P.falciparum e P.vivax está entre as mais altas do país. O estudo será localizado na comuna de Chu'R Cam, onde a equipe do estudo trabalhará com a equipe de saúde local e todas as comunas vizinhas com pacientes com malária.

A população local é composta principalmente pela minoria étnica JaRai e a ocupação principal consiste na agricultura de corte e queima (principalmente milho, mandioca e arroz) em campos florestais, juntamente com o trabalho sazonal em plantações de borracha e produção em pequena escala de bens para o dia a dia subsistência ou comércio, por ex. café e castanha de caju. O clima é tropical com estação seca de novembro a abril e estação chuvosa de maio a outubro. A área é montanhosa e arborizada (floresta secundária) e o principal vetor da malária é o Anopheles dirus.

3.4 População do ensaio A população-alvo inclui todos os pacientes infectados por P.vivax (crianças e adultos) apresentando-se espontaneamente no CHC ou identificados por meio de triagem ativa na comunidade.

3.5 Procedimentos do estudo 3.5.1 Triagem e recrutamento Todos os pacientes que atendem aos critérios básicos de inclusão durante a triagem receberão um número de triagem consecutivo e serão avaliados em maior profundidade pelo médico. Uma vez que o paciente atenda a todos os critérios de inclusão, ele (ou um dos pais ou responsável no caso de crianças) será solicitado a consentir em participar do estudo. Em seguida, será atribuído a ele um número de estudo (ID=numeração sequencial). Qualquer pessoa que decidir não participar do estudo será examinada, tratada e acompanhada pela equipe da unidade de saúde de acordo com o padrão de atendimento estabelecido pelo Ministério da Saúde.

Na inscrição (Dia 0), o paciente será examinado e um questionário pré-codificado padronizado será preenchido. Uma amostra de sangue venoso será coletada em tubos vacutainer estéreis contendo EDTA ou ácido-citrato-dextrose (EDTA/ACD) de todos os pacientes no momento da inscrição. Serão coletados no mínimo 5ml de sangue -e no máximo 8ml- em adultos, e 1ml/kg até 5ml em crianças. Duas gotas de sangue serão adicionadas a um tubo de 1,5 ml contendo 500 µL de reagente RNAprotect (Qiagen).

3.5.2 Tratamento Todos os pacientes receberão um tratamento completo com CQ na dose de 25 mg de CQ base por kg de peso corporal (pc) administrado durante 3 dias e sob supervisão direta. Os pacientes serão observados por 60 minutos após o tratamento para reações adversas ou vômitos. Os pacientes que vomitarem a medicação nos primeiros 30 minutos receberão uma dose completa repetida; aqueles que vomitam de 30 a 60 minutos receberão meia dose. Se o paciente vomitar novamente, ele será retirado e receberá uma terapia de resgate.

Medicação de resgate:

Oral=CQ (3 dias, 25mg/kg) junto com primaquina (0,25mg/kg/dia por 14 dias); Intravenosa (IV)= Artesunato (4mg/kg/dia) por no mínimo 24h e até que o paciente esteja apto a tomar a droga via oral. Em seguida, continue com DHA-PPQ oral por 3 dias.

Cura radical. o tratamento com primaquina será adiado até o final do acompanhamento e administrado conforme recomendado pelas diretrizes nacionais, ou seja, 0,25mg/kg/dia por 14 dias a todos os pacientes com teste rápido G6PD negativo.

3.5.3 Acompanhamento Do dia 0 até a eliminação do parasita, os pacientes serão monitorados a cada 12 horas por microscopia de sangue pelo menos até o dia 3 e mais, se necessário, até a eliminação do parasita definida como duas lâminas negativas consecutivas.

Em cada visita, o paciente será entrevistado e examinado e uma amostra de sangue de picada no dedo será coletada para os seguintes resultados: duas lâminas de sangue para observação de LM (filme grosso e fino), 200μl de sangue em um tubo microtainer EDTA/ACD para DNA extração e 2 gotas de sangue em outro tubo microtainer contendo RNAprotect para extração de RNA. No Dia 3, uma gota adicional de sangue será coletada para medir a concentração de Hb com o método Hemocue.

Dia 7, 14, 21, 28, 35, 42 Os pacientes serão entrevistados e examinados, o formulário de acompanhamento será preenchido e qualquer evento adverso documentado. Uma amostra de sangue por picada no dedo será coletada para os seguintes resultados: duas lâminas de sangue para observação de LM (filme espesso e fino), 200μl de sangue em um tubo microtainer EDTA/ACD para extração de DNA e 2 gotas de sangue em tubo microtainer contendo RNAprotect .

Além disso, no dia 7, 100μl de sangue serão coletados em papel de filtro para determinar a concentração de CQ no sangue. Nos dias 7, 14, 28 e 42, a concentração de Hb (Hemocue) será medida por picada no dedo.

Dia da recorrência de P.vivax: Se a recorrência for confirmada, uma nova amostra de sangue venoso será coletada antes da administração do tratamento de resgate. 100μl deste sangue venoso serão manchados em papel de filtro para determinar a concentração de CQ no sangue, sendo o restante utilizado para ensaio ex vivo e criopreservação conforme detalhado no Anexo VI-C.

3.5.4 Perda de violação do protocolo de acompanhamento A perda de acompanhamento ocorre quando, apesar de todos os esforços razoáveis, um paciente inscrito não comparece às consultas agendadas e não pode ser encontrado. Nenhum resultado do tratamento será atribuído a esses pacientes. Esses pacientes serão classificados como perdidos no seguimento e censurados ou excluídos da análise.

Os pacientes do estudo que atenderem a qualquer um dos seguintes critérios serão classificados como desistentes: i) retirada do consentimento; ii) não conclusão do tratamento; iii) eventos adversos graves que exijam a interrupção do tratamento antes que o curso completo seja concluído; iv) violação de inscrição; v) violação voluntária de protocolo; vi) violação involuntária do protocolo

3.5.5 Procedimentos laboratoriais e avaliação Microscopia Três lâminas (esfregaços de sangue fino/espesso) devem ser obtidas na triagem, sendo uma corada rapidamente (10% Giemsa por 10 min) para exame em um número limitado de campos para garantir a presença de formas assexuadas de P. vivax a uma parasitemia mínima de 250/ul. Uma vez inscrito o paciente, as outras duas lâminas serão coradas com mais cuidado (3% Giemsa por 45 min). A densidade será expressa como o número de parasitas assexuados por µl de sangue e calculada dividindo o número de parasitas assexuados pelo número de leucócitos contados e corrigidos pela densidade estimada de leucócitos (normalmente 8.000 por µl). Quando a contagem de parasitas assexuais for inferior a 10 por 200 glóbulos brancos, a contagem será feita em pelo menos 500 glóbulos brancos. Uma lâmina de sangue será considerada negativa quando o exame de 1.000 leucócitos não revelar parasitas assexuados.

• Parasitemia em estágio de anel: O número de estágios de anel será contado em todas as lâminas positivas no Dia 0 e no Dia de recorrência contra 200 parasitas assexuados; apenas isolados para os quais a proporção de estágios de anel excede 65% serão usados ​​para o ensaio de drogas ex vivo.
• Gametócitos: a densidade será computada pela contagem do número de gametócitos por 500 leucócitos.

Níveis de hemoglobina Os níveis de Hb serão medidos em sangue total coletado em microcuveta usando Hemocue seguindo as instruções do fabricante.

Medição da concentração de CQ no dia 7 e no dia da recorrência a partir de 100 µl de sangue expelido em papel cromatográfico (31ETCHR, Whatman). A confirmação molecular das espécies de Plasmodium no dia 0 será realizada por qPCR visando o gene ribossomal 18S. O mesmo método qPCR será usado para identificar e quantificar infecções por P. vivax no dia 0 e amostras de acompanhamento.

Os genótipos de P. vivax serão identificados através da amplificação por PCR de 3 marcadores particularmente eficazes para impressão digital em ensaios clínicos (MS16, Pv3.2 e msp1F3) seguido de eletroforese capilar em gel.

Extração de RNA e RT-qPCR para gametócitos O RNA será extraído de amostras de RNAprotect no ITM/NIMPE usando colunas de afinidade e digestão com DNAse de DNA genômico. Para detectar e quantificar os estágios do gametócito de P. vivax, uma transcrição reversa qPCR (RT-qPCR) visando os transcritos do gene Pvs25 será feita no D0 e em todas as amostras de acompanhamento.

Análise laboratorial de resistência a drogas (Dia 0 e de recorrência) Resumidamente, o sangue será centrifugado e o plasma armazenado a -20ºC. A parte superior do buffy coat será cuidadosamente removida e armazenada a -20ºC. Os glóbulos vermelhos (RBCs) serão ressuspensos em PBS (1:1) e os leucócitos serão depletados usando colunas de celulose (Sigma). As células filtradas serão lavadas e o sedimento medido antes da ressuspensão a 50% de hematócrito em meio McCoy (mistura de meio de sangue, BMM, 4ml).

Ensaios de sensibilidade a drogas ex vivo: Resumidamente, placas com diluições pré-doseadas de 7 pontos e 2 vezes de CQ, PPQ, DHA e quinina serão preparadas seguindo os procedimentos WWARN [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. As concentrações inibitórias mínimas e IC50 serão calculadas usando a ferramenta de análise e relatório in vitro (IVART) desenvolvida online pela WWARN.

Teste de deficiência de G6PD: todos os pacientes serão testados para deficiência de G6PD usando o teste no local de atendimento da CareStart (Access Bio, New Jersey, EUA) antes do tratamento com PQ.

4. As visitas de monitoramento do site de garantia de qualidade serão agendadas regularmente. Durante essas visitas, as informações registradas nos formulários de relato de caso serão verificadas em relação aos documentos originais. Depois que os formulários de relatório de caso forem reunidos no final do estudo, eles serão revisados ​​quanto à integridade e precisão. Os dados serão inseridos duplamente em um banco de dados eletrônico, onde verificações de computador especialmente projetadas são usadas para identificar violações de protocolo selecionadas e erros de dados.

Todos os esfregaços de sangue na admissão serão lidos no local do estudo, bem como por um microscopista sênior em um centro coordenador. Além disso, um controle de qualidade externo será feito no ITM em 10% das lâminas selecionadas aleatoriamente. Para cada um dos ensaios moleculares (qPCR, RT-qPCR e genotipagem de parasitas) 10% das amostras processadas no NIMPE serão escolhidas aleatoriamente para serem reanalisadas no ITM. O controle de qualidade externo dos resultados do ensaio de drogas ex vivo será feito no ITM, onde as lâminas serão reexaminadas para 10% dos isolados escolhidos aleatoriamente.

5. Plano analítico estatístico A análise da taxa de cura do dia 42 será realizada tanto para a população de pacientes com intenção de tratar (ITT) quanto para a população de pacientes avaliáveis ​​(por protocolo). A análise dos dados será realizada no software STATA 12. Para as variáveis ​​categóricas, as porcentagens e respectivos intervalos de confiança de 95% serão calculados seguindo o método de Wilson. As proporções serão comparadas calculando o *2 com correção de Yates ou pelo teste exato de Fisher, quando apropriado. Dados contínuos normalmente distribuídos serão comparados pelo teste t de Student e análise de variância. Os dados que não obedecerem a uma distribuição normal serão comparados pelo teste U de Mann-Whitney ou análise de variância de Kruskal-Wallis. A correlação entre 2 variáveis ​​contínuas será avaliada usando o coeficiente de correlação de classificação de Pearson ou Spearman, conforme necessário.

O risco geral de falha do tratamento no dia 28 e no dia 42 será calculado pelo método Kaplan Meier, e as comparações entre os grupos de risco serão feitas usando o teste de log rank. O risco ajustado por PCR nos dias 28 e 42 também será calculado seguindo os resultados de genotipagem de cada infecção recorrente por P.vivax. O tempo e a taxa de eliminação do parasita serão estimados usando a ferramenta on-line PCE desenvolvida pela WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). O IC50 e IC90 médios para CQ serão estimados usando a ferramenta de análise e relatório in vitro (IVART) desenvolvida pela WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

As alterações hematológicas serão avaliadas medindo-se as alterações na concentração de Hb entre os dias 0, 3, 7, 14, 28 e 42, respectivamente.

6. Questões Éticas 6.1 A autorização ética para conduzir o estudo terá sido obtida do Comitê de Ética do NIMPE, Hanoi e do Comitê de Ética da Universidade de Antuérpia, bem como do Conselho de Revisão Institucional do ITM, Anwerp.

6.2 Processo de Consentimento Os pacientes serão incluídos no estudo somente se eles (ou pais ou responsáveis ​​pelas crianças) derem consentimento informado. A solicitação de consentimento está disponível em inglês e traduzida para o vietnamita para ser lida integralmente ao paciente, pai ou responsável. Detalhes sobre o estudo e seus benefícios e riscos potenciais serão explicados. Esclarecidas as dúvidas, será solicitada a assinatura no documento. Se o paciente for analfabeto, uma testemunha alfabetizada deve assinar; se possível, o signatário será escolhido pelo participante e não terá vínculo com a equipe de pesquisa.