Utvärdera effekten av klorokin för behandling av Plasmodium Vivax-infektioner i centrala Vietnam

3.1 Studiedesign Denna studie är utformad som en 42-dagars studie av läkemedelseffekt för att utvärdera kliniska och parasitologiska svar efter behandling av P.vivax malariainfektioner. Symtomatiska patienter med P. vivax mono-infektioner, som uppfyller studiekriterierna, kommer att inkluderas i studien och behandlas med CQ (total dos 25gm/kg under 3 dagar). Behandlingen kommer att observeras direkt och patienterna kommer att följas aktivt upp i 42 dagar enligt ett utökat WHO-protokoll. Vid slutet av uppföljningstiden kommer alla patienter att behandlas med primaquine enligt nationella riktlinjer för radikal bot av P.vivax-infektioner.

3.2 Studieplats och population Studien kommer att genomföras i Krong Pa-distriktet, Gia Lai-provinsen där både P.falciparum och P.vivax malariaincidens är bland de högsta i landet. Studien kommer att placeras i Chu'R Cam kommun där studieteamet kommer att arbeta med den lokala hälsopersonalen och alla omgivande kommuner med malariapatienter.

Lokalbefolkningen består huvudsakligen av den etniska minoriteten JaRai och den huvudsakliga sysselsättningen består av slash and burn jordbruk (främst majs, maniok och ris) i skogsfält, tillsammans med säsongsarbete i gummiplantager och småskalig produktion av varor för dagligt bruk uppehälle eller handel t.ex. kaffe och cashewnötter. Klimatet är tropiskt med torrperioden från november till april och regnperioden från maj till oktober. Området är kuperat och skogbevuxet (sekundärskog) och den huvudsakliga malariavektorn är Anopheles dirus.

3.4 Försökspopulation Målpopulationen inkluderar alla P.vivax-infekterade patienter (barn och vuxna) som antingen uppträder spontant på CHC eller identifieras genom aktiv screening i samhället.

3.5 Prövningsförfaranden 3.5.1 Screening och rekrytering Alla konsulterande patienter som uppfyller de grundläggande registreringskriterierna under screening kommer att tilldelas ett kontinuerligt screeningnummer och utvärderas mer ingående av läkaren. När patienten uppfyller alla registreringskriterier kommer han eller hon (eller en förälder eller vårdnadshavare i fråga om barn) att uppmanas om samtycke för att delta i studien. Därefter kommer han/hon att tilldelas ett studienummer (ID=sekventiell numrering). Varje person som beslutar sig för att inte delta i studien kommer att undersökas, behandlas och följas upp av vårdinrättningens personal enligt den vårdstandard som fastställts av hälsoministeriet.

Vid inskrivning (dag 0) kommer patienten att undersökas och ett standardiserat förkodat frågeformulär kommer att fyllas i. Ett venöst blodprov kommer att samlas in i sterila vacutainerrör som innehåller EDTA eller syra-citrat-dextros (EDTA/ACD) från alla patienter vid inskrivningen. Minst 5 ml blod - och högst 8 ml - kommer att samlas in från vuxna, och 1 ml/kg upp till 5 ml kommer att samlas in från barn. Två bloddroppar tillsätts i ett 1,5 ml rör som innehåller 500 µL RNAprotect-reagens (Qiagen).

3.5.2 Behandling Alla patienter kommer att få en fullständig behandling med CQ i en dos av 25 mg CQ bas per kg kroppsvikt (kroppsvikt) under 3 dagar och under direkt övervakning. Patienter kommer att observeras i 60 minuter efter behandling för biverkningar eller kräkningar. De patienter som kräks sin medicin inom de första 30 minuterna kommer att få en upprepad full dos; de som kräks från 30-60 minuter kommer att få halv dos. Om patienten kräks igen kommer han eller hon att dras tillbaka och erbjudas räddningsterapi.

Räddningsmedicin:

Oral=CQ (3 dagar, 25 mg/kg) tillsammans med primakin (0,25 mg/kg/dag i 14 dagar); Intravenös (IV)= Artesunate (4mg/kg/dag) i minst 24 timmar och tills patienten kan ta oralt läkemedel. Fortsätt sedan med oral DHA-PPQ i 3 dagar.

Radikalt botemedel. primakinbehandling kommer att skjutas upp till slutet av uppföljningen och ges enligt de nationella riktlinjerna, dvs 0,25 mg/kg/dag i 14 dagar till alla patienter med negativt G6PD-snabbtest.

3.5.3 Uppföljning Från dag 0 tills parasitclearance patienter kommer att övervakas var 12:e timme med blodmikroskopi åtminstone fram till dag 3 och längre om nödvändigt tills parasitclearance definieras som två på varandra följande negativa objektglas.

Vid varje besök kommer patienten att intervjuas och undersökas och ett fingersticksblodprov kommer att samlas in för följande resultat: två blodglas för LM-observation (tjock och tunn film), 200 μl blod i ett EDTA/ACD-mikrotainerrör för DNA extraktion och 2 droppar blod i ett annat mikrotainerrör som innehåller RNAprotect för RNA-extraktion. På dag 3 kommer ytterligare en droppe blod att tas för att mäta Hb-koncentrationen med Hemocue-metoden.

Dag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Patienterna kommer att intervjuas och undersökas, uppföljningsformuläret kommer att fyllas i och eventuella biverkningar dokumenteras. Ett fingersticksblodprov kommer att samlas in för följande resultat: två blodglas för LM-observation (tjock och tunn film), 200 μl blod i ett EDTA/ACD-mikrotainerrör för DNA-extraktion och 2 droppar blod i RNAprotect-innehållande mikrotainerrör .

Dessutom, på dag 7, kommer 100 μl blod att tas på filterpapper för att bestämma blodets CQ-koncentration. På dag 7, 14, 28 och 42 kommer Hb-koncentrationen (Hemocue) att mätas från fingerstick.

Dag för P.vivax-recidiv: Om återfall bekräftas kommer ytterligare ett venöst blodprov att tas innan räddningsbehandlingen administreras. 100 μl av detta venösa blod kommer att placeras på filterpapper för att bestämma blodets CQ-koncentration, resten används för ex vivo-analys och kryokonservering enligt beskrivning i bilaga VI-C.

3.5.4 Förlust av brott mot uppföljningsprotokoll Förlust till uppföljning uppstår när, trots alla rimliga ansträngningar, en inskriven patient inte deltar i de planerade besöken och inte kan hittas. Inget behandlingsresultat kommer att tilldelas dessa patienter. Dessa patienter kommer att klassificeras som förlorade för uppföljning och censureras eller exkluderas från analysen.

Studiepatienter som uppfyller något av följande kriterier kommer att klassificeras som återkallade: i) återkallande av samtycke; ii) misslyckande med att fullfölja behandlingen; iii) allvarliga biverkningar som gör att behandlingen måste avslutas innan hela kuren är avslutad; iv) registreringsöverträdelse; v) frivilligt protokollöverträdelse; vi) ofrivilligt protokollöverträdelse

3.5.5 Laboratorieprocedurer och utvärdering Mikroskopi Tre objektglas (tunna/tjocka blodutstryk) bör erhållas vid screening, varav en färgas snabbt (10 % Giemsa i 10 minuter) för undersökning i ett begränsat antal fält för att säkerställa närvaron av asexuella former av P.vivax vid ett minimum parasitemi på 250/ul. När patienten väl har registrerats kommer de andra två objektglasen att färgas noggrannare (3 % Giemsa i 45 min). Densitet, kommer att uttryckas som antalet asexuella parasiter per µl blod, och beräknas genom att dividera antalet asexuella parasiter med antalet WBC som räknas och korrigeras med den uppskattade WBC-densiteten (vanligtvis 8000 per µl). När antalet asexuella parasiter är mindre än 10 per 200 WBC, kommer räkning att göras mot minst 500 WBC. Ett blodglidning kommer att betraktas som negativt när undersökning av 1000 WBC avslöjar inga asexuella parasiter.

• Ringstadiumparasitemi: Antalet ringstadier kommer att räknas i alla positiva objektglas på dag 0 och på dagen för återfall mot 200 asexuella parasiter; endast isolat för vilka andelen ringsteg överstiger 65 % kommer att användas för ex vivo-läkemedelsanalysen.
• Gametocyter: densiteten kommer att beräknas genom att räkna antalet gametocyter per 500 WBC.

Hemoglobinnivåer Hb-nivåer kommer att mätas på helblod som samlats in i mikrokyvett med Hemocue enligt tillverkarens instruktioner.

Mätning av CQ-koncentrationen på dag 7 och dagen för återfall från 100 µl blod som skjutits ut på kromatografipapper (31ETCHR, Whatman) Parasitmolekylär detektion och genotypning av DNA kommer att extraheras vid ITM/NIMPE från blodprover med fingerstick som samlas in i mikrobehållare. Molekylär bekräftelse av Plasmodium-arter på dag 0 kommer att utföras med qPCR som riktar in sig på 18S ribosomal gen. Samma qPCR-metod kommer att användas för att identifiera och kvantifiera P. vivax-infektioner på dag 0 och följa upp prover.

P. vivax-genotyper kommer att identifieras genom PCR-amplifiering av 3 markörer som är särskilt effektiva för fingeravtryck i kliniska prövningar (MS16, Pv3.2 och msp1F3) följt av kapillärgelelektrofores.

RNA-extraktion och RT-qPCR för gametocyter RNA kommer att extraheras från RNAprotect-prover vid ITM/NIMPE med användning av affinitetskolonner och DNAs-digestion av genomiskt DNA. För att detektera och kvantifiera P. vivax gametocytstadier kommer en omvänd transkription qPCR (RT-qPCR) riktad mot Pvs25-gentranskript att göras på D0 och i alla uppföljningsprover.

Läkemedelsresistens laboratorieanalys (dag 0 och återfall) I korthet kommer blod att centrifugeras och plasma kommer att lagras vid -20ºC. Den övre delen av buffy coat tas försiktigt bort och förvaras vid -20ºC. Röda blodkroppar (RBC) kommer att återsuspenderas i PBS (1:1) och leukocyter kommer att utarmas med hjälp av cellulosakolonner (Sigma). Filtrerade celler kommer att tvättas och pellets mätas före återsuspendering vid 50 % hematokrit i McCoy-medium (blodmediumblandning, BMM, 4 ml).

Ex vivo läkemedelskänslighetsanalyser: Kortfattat kommer plattor med fördoserade 7-punkts 2-faldiga spädningar av CQ, PPQ, DHA och kinin att beredas enligt WWARN-procedurer [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Minimala hämmande koncentrationer och IC50 kommer att beräknas med hjälp av In Vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) som utvecklats online av WWARN.

G6PD-bristtest: alla patienter kommer att testas för G6PD-brist med hjälp av point-of-care-testet av CareStart (Access Bio, New Jersey, USA) före PQ-behandling.

4. Kvalitetssäkring Övervakningsbesök på plats kommer att schemaläggas regelbundet. Under dessa besök kommer information som registrerats på fallrapportformulären att verifieras mot källdokument. Efter att fallrapportformulären har samlats i slutet av rättegången kommer de att granskas för fullständighet och riktighet. Uppgifterna kommer att dubbelinföras i en elektronisk databas, där specialdesignade datorkontroller används för att identifiera utvalda protokollöverträdelser och datafel.

Alla blodfilmer vid antagning kommer att läsas på studieplatsen samt av en senior mikroskopist vid ett koordinerande centrum. Dessutom kommer en extern kvalitetskontroll att göras på ITM på 10 % av slumpmässigt utvalda bilder. För var och en av de molekylära analyserna (qPCR, RT-qPCR och parasitgenotypning) kommer 10 % av proverna som bearbetas vid NIMPE att väljas slumpmässigt för att analyseras på nytt vid ITM. Extern kvalitetskontroll av ex vivo läkemedelsanalysresultat kommer att göras vid ITM där objektglasen kommer att undersökas på nytt för 10 % av de slumpmässigt valda isolaten.

5. Statistisk analytisk plan Analysen av botningsfrekvensen Dag 42 kommer att utföras både för intention-to-treat (ITT) patientpopulationen och den utvärderbara patientpopulationen (Per Protocol). Dataanalyser kommer att utföras med programvaran STATA 12. För kategoriska variabler kommer procentsatser och motsvarande 95 % konfidensintervall att beräknas enligt Wilsons metod. Proportioner kommer att jämföras genom att beräkna *2 med Yates korrigering eller genom Fishers exakta test där så är lämpligt. Normalfördelade kontinuerliga data kommer att jämföras med Students t-test och variansanalys. Data som inte överensstämmer med en normalfördelning kommer att jämföras med Mann-Whitney U-testet eller Kruskal-Wallis variansanalys. Korrelationen mellan 2 kontinuerliga variabler kommer att bedömas med antingen Pearson eller Spearmans rankkorrelationskoefficient efter behov.

Den totala risken för behandlingsmisslyckande dag 28 och dag 42 kommer att beräknas med Kaplan Meiers metod, och jämförelser mellan riskgrupper kommer att göras med hjälp av log rank test. Den PCR-justerade risken vid dag 28 och 42 kommer också att beräknas efter genotypningsresultaten för varje återkommande P.vivax-infektion. Parasitrensningstid och hastighet kommer att uppskattas med hjälp av PCE-onlineverktyget utvecklat av WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). Medelvärdet för IC50 och IC90 för CQ kommer att uppskattas med hjälp av In vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) utvecklat av WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Hematologiska förändringar kommer att utvärderas genom att mäta förändringarna i Hb-koncentrationen mellan dag 0, 3, 7, 14, 28 respektive 42.

6. Etiska frågor 6.1 Etiskt tillstånd för att genomföra studien kommer att ha erhållits från den etiska kommittén vid NIMPE, Hanoi och från den etiska kommittén vid universitetet i Antwerpen, samt från den institutionella granskningsnämnden vid ITM, Antwerpen.

6.2 Samtyckesprocess Patienter kommer endast att inkluderas i studien om de (eller föräldrar eller vårdnadshavare till barn) ger informerat samtycke. Begäran om samtycke är tillgänglig på engelska och översatt till vietnamesiska för att läsas helt för patienten, föräldern eller vårdnadshavaren. Detaljer om prövningen och dess fördelar och potentiella risker kommer att förklaras. När eventuella frågor har besvarats kommer en underskrift att begäras på dokumentet. Om patienten är analfabet måste ett läskunnigt vittne skriva under; om möjligt kommer undertecknaren att väljas av deltagaren och kommer inte att ha någon koppling till forskargruppen.