Évaluation de l'efficacité de la chloroquine pour le traitement des infections à Plasmodium Vivax dans le centre du Vietnam

3.1 Conception de l'étude Cette étude est conçue comme une étude d'efficacité médicamenteuse de 42 jours pour évaluer les réponses cliniques et parasitologiques après le traitement des infections palustres à P. vivax. Les patients symptomatiques atteints de mono-infections à P. vivax, répondant aux critères de l'étude, seront recrutés dans l'étude et traités par CQ (dose totale de 25 g/kg sur 3 jours). Le traitement sera directement observé et les patients seront activement suivis pendant 42 jours selon un protocole étendu de l'OMS. À la fin de la période de suivi, tous les patients seront traités avec de la primaquine conformément aux directives nationales pour la guérison radicale des infections à P.vivax.

3.2 Site et population de l'étude L'étude sera menée dans le district de Krong Pa, province de Gia Lai, où l'incidence du paludisme à P.falciparum et à P.vivax est parmi les plus élevées du pays. L'étude sera située dans la commune de Chu'R Cam où l'équipe d'étude travaillera avec le personnel de santé local et toutes les communes environnantes avec des patients atteints de paludisme.

La population locale est principalement composée de la minorité ethnique JaRai et l'occupation principale consiste en l'agriculture itinérante sur brûlis (principalement du maïs, du manioc et du riz) dans les champs forestiers, ainsi que le travail saisonnier dans les plantations de caoutchouc et la production à petite échelle de biens pour les besoins quotidiens. subsistance ou commerce, par ex. café et noix de cajou. Le climat est tropical avec la saison sèche de novembre à avril et la saison des pluies de mai à octobre. La zone est vallonnée et boisée (forêt secondaire) et le principal vecteur du paludisme est Anopheles dirus.

3.4 Population de l'essai La population cible comprend tous les patients infectés par P. vivax (enfants et adultes) soit se présentant spontanément au CSC, soit identifiés par dépistage actif dans la communauté.

3.5 Procédures d'essai 3.5.1 Dépistage et recrutement Tous les patients consultant qui répondent aux critères d'inscription de base lors du dépistage se verront attribuer un numéro de dépistage consécutif et seront évalués plus en profondeur par le médecin. Une fois que le patient répond à tous les critères d'inscription, il lui sera demandé (ou un parent ou un tuteur dans le cas d'enfants) son consentement à participer à l'étude. Ensuite, il/elle se verra attribuer un numéro d'étude (ID=numérotation séquentielle). Toute personne qui décide de ne pas participer à l'étude sera examinée, traitée et suivie par le personnel de l'établissement de santé selon la norme de soins établie par le ministère de la Santé.

Lors de l'inscription (jour 0), le patient sera examiné et un questionnaire précodé standardisé sera rempli. Un échantillon de sang veineux sera prélevé dans des tubes Vacutainer stériles contenant de l'EDTA ou de l'acide-citrate-dextrose (EDTA/ACD) de tous les patients lors de l'inscription. Un minimum de 5 ml de sang - et un maximum de 8 ml - sera prélevé sur les adultes, et 1 ml/kg jusqu'à 5 ml sera prélevé sur les enfants. Deux gouttes de sang seront ajoutées dans un tube de 1,5 ml contenant 500 µL de réactif RNAprotect (Qiagen).

3.5.2 Traitement Tous les patients recevront un traitement complet avec CQ à une dose de 25 mg de base de CQ par kg de poids corporel (pc) administré pendant 3 jours et sous surveillance directe. Les patients seront observés pendant 60 minutes après le traitement pour des effets indésirables ou des vomissements. Les patients qui vomissent leur médicament dans les 30 premières minutes recevront une dose complète répétée ; ceux qui vomissent de 30 à 60 minutes recevront une demi-dose. Si le patient vomit à nouveau, il sera retiré et on lui proposera une thérapie de sauvetage.

Médicament de secours :

Oral = CQ (3 jours, 25 mg/kg) avec primaquine (0,25 mg/kg/jour pendant 14 jours) ; Intraveineuse (IV) = Artésunate (4mg/kg/jour) pendant au moins 24h et jusqu'à ce que le patient soit capable de prendre le médicament par voie orale. Continuez ensuite avec le DHA-PPQ oral pendant 3 jours.

Cure radicale. le traitement à la primaquine sera reporté jusqu'à la fin du suivi, et administré conformément aux recommandations nationales, soit 0,25 mg/kg/jour pendant 14 jours à tous les patients ayant un test rapide G6PD négatif.

3.5.3 Suivi Du jour 0 jusqu'à la clairance parasitaire, les patients seront suivis toutes les 12 heures par microscopie sanguine au moins jusqu'au jour 3 et plus si nécessaire jusqu'à la clairance parasitaire définie par deux lames négatives consécutives.

À chaque visite, le patient sera interrogé et examiné et un échantillon de sang par piqûre au doigt sera prélevé pour les résultats suivants : deux lames de sang pour l'observation LM (film épais et mince), 200 μl de sang dans un tube microtainer EDTA/ACD pour l'ADN extraction et 2 gouttes de sang dans un autre tube microtainer contenant RNAprotect pour l'extraction de l'ARN. Au jour 3, une goutte de sang supplémentaire sera prélevée pour mesurer la concentration en Hb avec la méthode Hemocue.

Jour 7, 14, 21, 28, 35, 42 Les patients seront interrogés et examinés, le formulaire de suivi sera rempli et tout événement indésirable documenté. Un échantillon de sang par piqûre au doigt sera prélevé pour les résultats suivants : deux lames de sang pour l'observation LM (film épais et mince), 200 μl de sang dans un tube microtainer EDTA/ACD pour l'extraction d'ADN et 2 gouttes de sang dans un tube microtainer contenant de l'ARNprotect .

De plus, au jour 7, 100 μl de sang seront prélevés sur du papier filtre pour déterminer la concentration sanguine en CQ. Aux jours 7, 14, 28 et 42, la concentration d'Hb (Hemocue) sera mesurée par piqûre au doigt.

Jour de la récurrence de P.vivax : si la récidive est confirmée, un autre échantillon de sang veineux sera prélevé avant l'administration du traitement de secours. 100 μl de ce sang veineux seront déposés sur du papier filtre pour déterminer la concentration de CQ dans le sang, le reste étant utilisé pour le dosage ex vivo et la cryoconservation comme détaillé à l'annexe VI-C.

3.5.4 Violations du protocole de perte de suivi Il y a perte de suivi lorsque, malgré tous les efforts raisonnables, un patient inscrit ne se présente pas aux visites prévues et est introuvable. Aucun résultat de traitement ne sera attribué à ces patients. Ces patients seront classés comme perdus de vue et censurés ou exclus de l'analyse.

Les patients de l'étude qui répondent à l'un des critères suivants seront classés comme retirés : i) retrait du consentement ; ii) non-achèvement du traitement ; iii) des événements indésirables graves nécessitant l'arrêt du traitement avant la fin du traitement complet ; iv) violation de l'inscription ; v) violation volontaire du protocole ; vi) violation involontaire du protocole

3.5.5 Procédures de laboratoire et évaluation Microscopie Trois lames (frottis sanguins minces/épais) doivent être obtenues lors du dépistage, l'une étant colorée rapidement (10 % de Giemsa pendant 10 min) pour examen dans un nombre limité de champs afin de s'assurer de la présence de formes asexuées de P.vivax à une parasitémie minimale de 250/ul. Une fois le patient inscrit, les deux autres lames seront colorées plus soigneusement (3% Giemsa pendant 45 min). La densité sera exprimée en nombre de parasites asexués par µl de sang et calculée en divisant le nombre de parasites asexués par le nombre de globules blancs comptés et corrigés par la densité de globules blancs estimée (généralement 8 000 par µl). Lorsque le nombre de parasites asexués est inférieur à 10 pour 200 globules blancs, le comptage sera effectué sur au moins 500 globules blancs. Une lame de sang sera considérée comme négative lorsque l'examen de 1000 globules blancs ne révèle aucun parasite asexué.

• Parasitémie en stade annulaire : le nombre de stades en anneau sera compté dans toutes les lames positives au jour 0 et au jour de récidive contre 200 parasites asexués ; seuls les isolats pour lesquels la proportion de stades annulaires dépasse 65 % seront utilisés pour le dosage ex vivo du médicament.
• Gamétocytes : la densité sera calculée en comptant le nombre de gamétocytes pour 500 globules blancs.

Taux d'hémoglobine Les taux d'Hb seront mesurés sur du sang total prélevé dans une microcuvette à l'aide d'Hemocue en suivant les instructions du fabricant.

Mesure de la concentration de CQ au jour 7 et au jour de la récidive à partir de 100 µl de sang expulsé sur du papier de chromatographie (31ETCHR, Whatman) Détection moléculaire des parasites et génotypage L'ADN sera extrait à l'IMT/NIMPE à partir d'échantillons de sang par piqûre au doigt collectés dans des microtainers. La confirmation moléculaire des espèces de Plasmodium au jour 0 sera effectuée par qPCR ciblant le gène ribosomique 18S. La même méthode qPCR sera utilisée pour identifier et quantifier les infections à P. vivax au jour 0 et suivre les échantillons.

Les génotypes de P. vivax seront identifiés par amplification par PCR de 3 marqueurs particulièrement efficaces pour la prise d'empreintes digitales dans les essais cliniques (MS16, Pv3.2 et msp1F3) suivie d'une électrophorèse sur gel capillaire.

Extraction d'ARN et RT-qPCR pour les gamétocytes L'ARN sera extrait d'échantillons RNAprotect à l'IMT/NIMPE à l'aide de colonnes d'affinité et d'une digestion par ADNase de l'ADN génomique. Pour détecter et quantifier les stades des gamétocytes de P. vivax, une qPCR de transcription inverse (RT-qPCR) ciblant les transcrits du gène Pvs25 sera effectuée à J0 et dans tous les échantillons de suivi.

Analyse en laboratoire de la résistance aux médicaments (Jour 0 et de récidive) Brièvement, le sang sera centrifugé et le plasma sera conservé à -20°C. La partie supérieure du buffy coat sera soigneusement retirée et conservée à -20ºC. Les globules rouges (RBC) seront remis en suspension dans du PBS (1:1) et les leucocytes seront déplétés à l'aide de colonnes de cellulose (Sigma). Les cellules filtrées seront lavées et le culot mesuré avant d'être remis en suspension à 50 % d'hématocrite dans du milieu McCoy (mélange de milieu sanguin, BMM, 4 ml).

Tests de sensibilité aux médicaments ex vivo : en bref, des plaques avec des dilutions prédosées en 7 points de CQ, PPQ, DHA et quinine seront préparées selon les procédures WWARN [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Les concentrations minimales inhibitrices et l'IC50 seront calculées à l'aide de l'outil d'analyse et de rapport in vitro (IVART) développé en ligne par le WWARN.

Test de déficit en G6PD : tous les patients seront testés pour le déficit en G6PD à l'aide du test au point de service de CareStart (Access Bio, New Jersey, États-Unis) avant le traitement par PQ.

4. Assurance qualité Des visites de contrôle du site seront programmées sur une base régulière. Au cours de ces visites, les informations enregistrées sur les formulaires de rapport de cas seront vérifiées par rapport aux documents sources. Une fois les formulaires de rapport de cas rassemblés à la fin de l'essai, ils seront examinés pour s'assurer qu'ils sont complets et exacts. Les données seront saisies deux fois dans une base de données électronique, où des contrôles informatiques spécialement conçus sont utilisés pour identifier les violations de protocole et les erreurs de données sélectionnées.

Tous les frottis sanguins à l'admission seront lus sur le site de l'étude ainsi que par un microscopiste senior dans un centre de coordination. De plus, un contrôle qualité externe sera effectué à l'IMT sur 10% des lames sélectionnées au hasard. Pour chacun des tests moléculaires (qPCR, RT-qPCR et génotypage parasitaire) 10% des échantillons traités au NIMPE seront choisis au hasard pour être ré-analysés à l'IMT. Le contrôle externe de la qualité des résultats des analyses de médicaments ex vivo sera effectué à l'IMT où les lames seront réexaminées pour 10 % des isolats choisis au hasard.

5. Plan d'analyse statistique L'analyse du taux de guérison au jour 42 sera effectuée à la fois pour la population de patients en intention de traiter (ITT) et pour la population de patients évaluables (per protocole). Les analyses de données seront effectuées à l'aide du logiciel STATA 12. Pour les variables catégorielles, les pourcentages et les intervalles de confiance à 95 % correspondants seront calculés selon la méthode de Wilson. Les proportions seront comparées en calculant le *2 avec la correction de Yates ou par le test exact de Fisher le cas échéant. Les données continues normalement distribuées seront comparées par le test t de Student et l'analyse de la variance. Les données non conformes à une distribution normale seront comparées par le test U de Mann-Whitney ou l'analyse de variance de Kruskal-Wallis. La corrélation entre 2 variables continues sera évaluée à l'aide du coefficient de corrélation de rang de Pearson ou de Spearman, selon les besoins.

Le risque global d'échec du traitement au jour 28 et au jour 42 sera calculé par la méthode de Kaplan Meier, et les comparaisons entre les groupes à risque seront effectuées à l'aide du test du log rank. Le risque ajusté par PCR aux jours 28 et 42 sera également calculé en fonction des résultats de génotypage de chaque infection récurrente à P. vivax. Le temps et le taux d'élimination des parasites seront estimés à l'aide de l'outil en ligne PCE développé par WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). Les IC50 et IC90 moyennes pour la CQ seront estimées à l'aide de l'outil d'analyse et de rapport in vitro (IVART) développé par WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Les changements hématologiques seront évalués en mesurant les changements de concentration d'Hb entre les jours 0, 3, 7, 14, 28 et 42, respectivement.

6. Questions éthiques 6.1 L'autorisation éthique pour mener l'étude aura été obtenue auprès du Comité d'éthique du NIMPE, Hanoï et du Comité d'éthique de l'Université d'Anvers, ainsi que du Comité d'examen institutionnel de l'IMT, Anvers.

6.2 Processus de consentement Les patients ne seront inclus dans l'étude que s'ils (ou les parents ou tuteurs des enfants) donnent leur consentement éclairé. La demande de consentement est disponible en anglais et traduite en vietnamien pour être lue entièrement au patient, parent ou tuteur. Des détails sur l'essai, ses avantages et ses risques potentiels seront expliqués. Une fois que toutes les questions auront été répondues, une signature sera demandée sur le document. Si le patient est analphabète, un témoin alphabétisé doit signer ; si possible, le signataire sera choisi par le participant et n'aura aucun lien avec l'équipe de recherche.