Оценка эффективности хлорохина для лечения инфекций Plasmodium Vivax в Центральном Вьетнаме

3.1 Дизайн исследования Это исследование разработано как 42-дневное исследование эффективности лекарственного средства для оценки клинических и паразитологических ответов после лечения малярийных инфекций, вызванных P.vivax. Симптоматические пациенты с моноинфекцией P. vivax, отвечающие критериям исследования, будут включены в исследование и получат лечение CQ (общая доза 25 г/кг в течение 3 дней). Лечение будет осуществляться под непосредственным наблюдением, и пациенты будут находиться под активным наблюдением в течение 42 дней в соответствии с расширенным протоколом ВОЗ. По истечении периода наблюдения все пациенты будут получать примахин в соответствии с национальными рекомендациями по радикальному излечению инфекций, вызванных P.vivax.

3.2 Место проведения исследования и популяция Исследование будет проводиться в округе Кронг Па, провинция Зя Лай, где заболеваемость малярией P.falciparum и P.vivax является одной из самых высоких в стране. Исследование будет проходить в коммуне Чу'Р Кам, где исследовательская группа будет работать с местным медицинским персоналом и всеми близлежащими коммунами с больными малярией.

Местное население в основном состоит из этнического меньшинства джарай, и основное занятие состоит из подсечно-огневого земледелия (в основном кукурузы, маниока и риса) на лесных полях, а также сезонных работ на каучуковых плантациях и мелкосерийного производства товаров для повседневного потребления. пропитание или торговля кофе и орехи кешью. Климат тропический с сухим сезоном с ноября по апрель и сезоном дождей с мая по октябрь. Район холмистый и засажен деревьями (вторичный лес), а основным переносчиком малярии является Anopheles dirus.

3.4 Исследуемая популяция Целевая популяция включает всех пациентов, инфицированных P. vivax (детей и взрослых), либо спонтанно обратившихся в ЦГП, либо выявленных в ходе активного скрининга среди населения.

3.5 Процедуры исследования 3.5.1 Скрининг и набор Всем консультируемым пациентам, которые соответствуют основным критериям включения во время скрининга, будет присвоен последовательный номер скрининга, и врач будет более тщательно их оценивать. Как только пациент соответствует всем критериям включения, его или ее (или родителя или опекуна в случае детей) попросят дать согласие на участие в исследовании. Затем ему/ей будет присвоен номер исследования (ID = порядковая нумерация). Любой человек, решивший не участвовать в исследовании, будет обследован, пролечен и под наблюдением персонала медицинского учреждения в соответствии со стандартом медицинской помощи, установленным Министерством здравоохранения.

При регистрации (день 0) пациент будет обследован и заполнен стандартизированным предварительно закодированным вопросником. Образец венозной крови будет собираться в стерильные пробирки для вакутейнеров, содержащие ЭДТА или кислотно-цитратно-декстрозный (ЭДТА/АКД) у всех пациентов при включении в исследование. У взрослых будет взято не менее 5 мл крови и не более 8 мл, а у детей — от 1 мл/кг до 5 мл. Две капли крови будут добавлены в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл реагента RNAprotect (Qiagen).

3.5.2 Лечение Все пациенты будут получать полный курс лечения CQ в дозе 25 мг основания CQ на кг массы тела (м.т.) в течение 3 дней и под непосредственным наблюдением. Пациенты будут наблюдаться в течение 60 минут после лечения на предмет побочных реакций или рвоты. Те пациенты, которые рвут свое лекарство в течение первых 30 минут, получат повторную полную дозу; те, кого рвет от 30 до 60 минут, получат половину дозы. Если пациента снова вырвет, его или ее выведут и предложат неотложную терапию.

Спасательное лекарство:

Перорально = CQ (3 дня, 25 мг/кг) вместе с примахином (0,25 мг/кг/день в течение 14 дней); Внутривенно (в/в) = артесунат (4 мг/кг/день) в течение как минимум 24 часов и до тех пор, пока пациент не сможет принимать лекарство перорально. Затем продолжите пероральный прием DHA-PPQ в течение 3 дней.

Радикальное излечение. Лечение примахином будет отложено до конца периода наблюдения и назначено в соответствии с рекомендациями национальных руководств, т. е. 0,25 мг/кг/день в течение 14 дней всем пациентам с отрицательным экспресс-тестом на Г6ФД.

3.5.3 Последующее наблюдение С 0-го дня до исчезновения паразитов пациенты будут контролироваться каждые 12 часов с помощью микроскопии крови, по крайней мере, до 3-го дня и дольше, если необходимо, до полного уничтожения паразитов, определяемого как два последовательных отрицательных слайда.

При каждом посещении пациента будут опрашивать и осматривать, а образец крови из пальца будет собираться для следующих результатов: два предметных стекла крови для наблюдения ЛМ (толстая и тонкая пленка), 200 мкл крови в микротейнерной пробирке с ЭДТА/АКД для ДНК. выделения и 2 капли крови в другую пробирку микротейнера, содержащую RNAprotect для выделения РНК. На 3-й день будет взята дополнительная капля крови для измерения концентрации гемоглобина с помощью метода Hemocue.

День 7, 14, 21, 28, 35, 42 Пациенты будут опрошены и обследованы, форма последующего наблюдения будет заполнена, а любое нежелательное явление будет задокументировано. Образец крови из пальца будет собран для следующих результатов: два предметных стекла крови для наблюдения ЛМ (толстая и тонкая пленка), 200 мкл крови в пробирке с микротейнерами с ЭДТА/АКД для выделения ДНК и 2 капли крови в пробирке с РНКзащитой. .

Кроме того, на 7-й день берут 100 мкл крови на фильтровальную бумагу для определения концентрации CQ в крови. На 7-й, 14-й, 28-й и 42-й дни концентрацию гемоглобина (Hemocue) измеряют по уколу пальца.

День рецидива P.vivax: если рецидив подтвердится, перед введением экстренного лечения будет взят дополнительный образец венозной крови. 100 мкл этой венозной крови наносят на фильтровальную бумагу для определения концентрации CQ в крови, а оставшуюся часть используют для анализа ex vivo и криоконсервации, как подробно описано в Приложении VI-C.

3.5.4 Потеря для последующего наблюдения Нарушения протокола Потеря для последующего наблюдения происходит, когда, несмотря на все разумные усилия, зарегистрированный пациент не посещает запланированные визиты и не может быть найден. Этим пациентам не будет назначен результат лечения. Эти пациенты будут классифицированы как потерянные для последующего наблюдения и подвергнуты цензуре или исключены из анализа.

Пациенты исследования, которые соответствуют любому из следующих критериев, будут классифицированы как выбывшие: i) отзыв согласия; ii) неспособность завершить лечение; iii) серьезные нежелательные явления, требующие прекращения лечения до завершения полного курса; iv) нарушение правил зачисления; v) добровольное нарушение протокола; vi) ненамеренное нарушение протокола

3.5.5 Лабораторные процедуры и оценка Микроскопия При скрининге необходимо получить три предметных стекла (тонкие/толстые мазки крови), одно из которых следует быстро окрасить (10% Гимза в течение 10 минут) для исследования в ограниченном числе полей, чтобы убедиться в наличии бесполых форм P.vivax. при минимальной паразитемии 250/мкл. Как только пациент будет зарегистрирован, два других предметных стекла будут окрашены более тщательно (3% Гимза в течение 45 минут). Плотность выражается как количество бесполых паразитов на мкл крови и рассчитывается путем деления количества бесполых паразитов на количество подсчитанных лейкоцитов и с поправкой на предполагаемую плотность лейкоцитов (обычно 8000 на мкл). Когда количество бесполых паразитов составляет менее 10 на 200 лейкоцитов, подсчет будет проводиться по крайней мере на 500 лейкоцитов. Мазок крови будет считаться отрицательным, если исследование 1000 лейкоцитов не выявит бесполых паразитов.

• Кольцевая стадия паразитемии: количество кольцевых стадий будет подсчитано во всех положительных предметных стеклах в день 0 и в день рецидива против 200 бесполых паразитов; только те изоляты, для которых доля кольцевых стадий превышает 65%, будут использоваться для анализа лекарств ex vivo.
• Гаметоциты: плотность будет рассчитываться путем подсчета количества гаметоцитов на 500 лейкоцитов.

Уровни гемоглобина Уровни гемоглобина будут измеряться в цельной крови, собранной в микрокювету с использованием Hemocue в соответствии с инструкциями производителя.

Измерение концентрации CQ на 7-й день и в день рецидива из 100 мкл крови, выброшенной на хроматографическую бумагу (31ETCHR, Whatman). ДНК для молекулярного обнаружения и генотипирования паразитов будет извлечена в ITM/NIMPE из образцов крови из пальца, собранных в микротейнеры. Молекулярное подтверждение наличия видов Plasmodium в день 0 будет выполнено с помощью количественной ПЦР, нацеленной на рибосомный ген 18S. Тот же метод количественной ПЦР будет использоваться для выявления и количественного определения инфекций, вызванных P. vivax, в День 0 и последующих образцов.

Генотипы P. vivax будут идентифицированы с помощью ПЦР-амплификации 3 маркеров, особенно эффективных для снятия отпечатков пальцев в клинических испытаниях (MS16, Pv3.2 и msp1F3), с последующим электрофорезом в капиллярном геле.

Экстракция РНК и RT-qPCR для гаметоцитов РНК будет экстрагирована из образцов RNAprotect в ITM/NIMPE с использованием аффинных колонок и расщепления ДНКазой геномной ДНК. Для обнаружения и количественной оценки стадий гаметоцитов P. vivax будет проведена количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR), нацеленная на транскрипты гена Pvs25, в день D0 и во всех последующих образцах.

Лабораторный анализ лекарственной устойчивости (день 0 и рецидив) Вкратце, кровь будет центрифугирована, а плазма будет храниться при -20ºC. Верхнюю часть лейкоцитарной пленки осторожно удаляют и хранят при температуре -20ºC. Красные кровяные тельца (эритроциты) ресуспендируют в PBS (1:1), а лейкоциты удаляют с использованием колонок с целлюлозой (Sigma). Отфильтрованные клетки промывают и измеряют осадок перед повторным суспендированием при 50% гематокрите в среде McCoy (смесь кровяной среды, BMM, 4 мл).

Анализы чувствительности к лекарствам ex vivo: Вкратце, планшеты с предварительно дозированными 7-точечными двукратными разведениями CQ, PPQ, DHA и хинина будут подготовлены в соответствии с процедурами WWARN [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Минимальные ингибирующие концентрации и IC50 будут рассчитываться с использованием инструмента анализа и отчетности in vitro (IVART), разработанного WWARN в режиме онлайн.

Тест на дефицит G6PD: все пациенты будут проверены на дефицит G6PD с помощью теста CareStart (Access Bio, Нью-Джерси, США) по месту оказания медицинской помощи перед лечением PQ.

4. Контрольные визиты на объект для обеспечения качества будут планироваться на регулярной основе. Во время этих посещений информация, записанная в формах отчетов о делах, будет сверяться с первичными документами. После того, как формы отчетов о случаях будут сопоставлены в конце судебного разбирательства, они будут проверены на предмет полноты и точности. Данные будут дважды внесены в электронную базу данных, где используются специально разработанные компьютерные проверки для выявления отдельных нарушений протокола и ошибок в данных.

Все мазки крови при поступлении будут прочитаны в исследовательском центре, а также старшим микроскопистом в координационном центре. Кроме того, в ITM будет проведен внешний контроль качества 10% случайно выбранных слайдов. Для каждого из молекулярных анализов (qPCR, RT-qPCR и генотипирование паразитов) 10% образцов, обработанных в NIMPE, будут случайным образом выбраны для повторного анализа в ITM. Внешний контроль качества результатов анализа лекарств ex vivo будет проводиться в ITM, где слайды будут повторно исследованы на наличие 10% случайно выбранных изолятов.

5. Статистический аналитический план. Анализ частоты излечения на 42-й день будет проводиться как для популяции пациентов, намеренных лечиться (ITT), так и для популяции пациентов, поддающихся оценке (согласно протоколу). Анализ данных будет выполняться с использованием программного обеспечения STATA 12. Для категориальных переменных проценты и соответствующие 95% доверительные интервалы будут рассчитываться по методу Уилсона. Пропорции будут сравниваться путем вычисления *2 с поправкой Йейтса или с помощью точного критерия Фишера, где это применимо. Нормально распределенные непрерывные данные будут сравниваться с помощью критерия Стьюдента и дисперсионного анализа. Данные, не соответствующие нормальному распределению, будут сравниваться с помощью U-критерия Манна-Уитни или дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса. Корреляция между двумя непрерывными переменными будет оцениваться с использованием коэффициента ранговой корреляции Пирсона или Спирмена по мере необходимости.

Общий риск неэффективности лечения к 28-му и 42-му дню будет рассчитываться по методу Каплана-Мейера, а сравнения между группами риска будут проводиться с использованием логарифмического рангового теста. Скорректированный с помощью ПЦР риск на 28-й и 42-й день также будет рассчитываться по результатам генотипирования каждой рецидивирующей инфекции P.vivax. Время и скорость очистки от паразитов будут оцениваться с помощью онлайн-инструмента PCE, разработанного WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). Средние IC50 и IC90 для CQ будут оцениваться с использованием инструмента анализа и отчетности in vitro (IVART), разработанного WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Гематологические изменения будут оцениваться путем измерения изменений концентрации гемоглобина между днями 0, 3, 7, 14, 28 и 42 соответственно.

6. Этические вопросы 6.1 Этическое разрешение на проведение исследования будет получено от Комитета по этике NIMPE, Ханой и от Комитета по этике Университета Антверпена, а также от Институционального наблюдательного совета ITM, Анверпен.

6.2 Процесс получения согласия Пациенты будут включены в исследование только в том случае, если они (или родители или опекуны детей) дадут информированное согласие. Запрос согласия доступен на английском языке и переведен на вьетнамский язык, чтобы его могли прочитать только пациент, родитель или опекун. Подробная информация об испытании и его преимуществах и потенциальных рисках будет объяснена. После того, как будут даны ответы на все вопросы, на документе будет запрошена подпись. Если больной неграмотен, должен расписаться грамотный свидетель; если возможно, подписавший будет выбран участником и не будет иметь никакого отношения к исследовательской группе.