Evaluación de la eficacia de la cloroquina para el tratamiento de infecciones por Plasmodium Vivax en el centro de Vietnam

3.1 Diseño del estudio Este estudio está diseñado como un estudio de eficacia del fármaco de 42 días para evaluar las respuestas clínicas y parasitológicas después del tratamiento de las infecciones de paludismo por P.vivax. Los pacientes sintomáticos con monoinfecciones por P. vivax que cumplan los criterios del estudio se incluirán en el estudio y se tratarán con CQ (dosis total de 25 g/kg durante 3 días). El tratamiento se observará directamente y los pacientes serán seguidos activamente durante 42 días según un protocolo ampliado de la OMS. Al final del tiempo de seguimiento, todos los pacientes serán tratados con primaquina siguiendo las pautas nacionales para la curación radical de las infecciones por P.vivax.

3.2 Sitio y población del estudio El estudio se llevará a cabo en el distrito de Krong Pa, provincia de Gia Lai, donde la incidencia de paludismo por P.falciparum y P.vivax se encuentra entre las más altas del país. El estudio se ubicará en la comuna de Chu'R Cam, donde el equipo de estudio trabajará con el personal de salud local y todas las comunas circundantes con pacientes de malaria.

La población local está compuesta principalmente por la minoría étnica JaRai y la principal ocupación consiste en la agricultura de tala y quema (principalmente maíz, mandioca y arroz) en los campos forestales, junto con el trabajo estacional en las plantaciones de caucho y la producción a pequeña escala de bienes para el consumo diario. subsistencia o comercio, p. café y anacardos. El clima es tropical con la estación seca de noviembre a abril y la estación lluviosa de mayo a octubre. El área es montañosa y boscosa (bosque secundario) y el principal vector de malaria es Anopheles dirus.

3.4 Población del ensayo La población objetivo incluye a todos los pacientes infectados por P.vivax (niños y adultos) que se presenten espontáneamente en el CHC o que se identifiquen a través de un cribado activo en la comunidad.

3.5 Procedimientos de prueba 3.5.1 Selección y reclutamiento A todos los pacientes de consulta que cumplan con los criterios básicos de inscripción durante la selección se les asignará un número de selección consecutivo y el médico los evaluará en mayor profundidad. Una vez que el paciente cumpla con todos los criterios de inscripción, se le pedirá a él o ella (o a un padre o tutor en el caso de niños) su consentimiento para participar en el estudio. Luego, se le asignará un número de estudio (ID=numeración secuencial). Toda persona que decida no participar en el estudio será examinada, tratada y acompañada por el personal del establecimiento de salud de acuerdo con el estándar de atención establecido por el Ministerio de Salud.

En el momento de la inscripción (día 0), se examinará al paciente y se completará un cuestionario precodificado estandarizado. Se recogerá una muestra de sangre venosa en tubos vacutainer estériles que contengan EDTA o ácido-citrato-dextrosa (EDTA/ACD) de todos los pacientes en el momento de la inscripción. Se recogerá un mínimo de 5ml de sangre -y un máximo de 8ml- de adultos, y de 1ml/kg hasta 5ml de niños. Se añadirán dos gotas de sangre a un tubo de 1,5 ml que contiene 500 µl de reactivo RNAprotect (Qiagen).

3.5.2 Tratamiento Todos los pacientes recibirán un tratamiento completo con CQ a una dosis de 25 mg de CQ base por kg de peso corporal (pc) administrada durante 3 días y bajo supervisión directa. Se observará a los pacientes durante 60 minutos después del tratamiento para detectar reacciones adversas o vómitos. Aquellos pacientes que vomiten su medicamento dentro de los primeros 30 minutos recibirán una dosis completa repetida; aquellos que vomiten de 30 a 60 minutos recibirán la mitad de la dosis. Si el paciente vuelve a vomitar, se le retirará y se le ofrecerá terapia de rescate.

Medicación de rescate:

Oral=CQ (3 días, 25 mg/kg) junto con primaquina (0,25 mg/kg/día durante 14 días); Intravenosa (IV)= Artesunato (4mg/kg/día) por un mínimo de 24h y hasta que el paciente pueda tomar el fármaco oral. Luego continúe con DHA-PPQ oral durante 3 días.

Cura radical. el tratamiento con primaquina se retrasará hasta el final del seguimiento y se administrará según lo recomendado por las directrices nacionales, es decir, 0,25 mg/kg/día durante 14 días a todos los pacientes con prueba rápida de G6PD negativa.

3.5.3 Seguimiento Desde el día 0 hasta la eliminación del parásito, los pacientes serán monitoreados cada 12 horas mediante microscopía de sangre al menos hasta el día 3 y más tiempo si es necesario hasta la eliminación del parásito definida como dos portaobjetos negativos consecutivos.

En cada visita, se entrevistará y examinará al paciente y se recolectará una muestra de sangre por punción en el dedo para obtener los siguientes resultados: dos láminas de sangre para observación de LM (película gruesa y delgada), 200 μl de sangre en un tubo microtainer con EDTA/ACD para ADN extracción y 2 gotas de sangre en otro tubo microtainer que contiene RNAprotect para la extracción de ARN. En el Día 3, se tomará una gota de sangre adicional para medir la concentración de Hb con el método Hemocue.

Día 7, 14, 21, 28, 35, 42 Se entrevistará y examinará a los pacientes, se completará el formulario de seguimiento y se documentará cualquier evento adverso. Se recolectará una muestra de sangre por punción digital para los siguientes resultados: dos portaobjetos de sangre para la observación de LM (película gruesa y delgada), 200 μl de sangre en un tubo microtainer con EDTA/ACD para la extracción de ADN y 2 gotas de sangre en un tubo microtainer que contiene RNAprotect .

Además, el día 7, se tomarán 100 μl de sangre en papel de filtro para determinar la concentración de CQ en sangre. En los días 7, 14, 28 y 42, se medirá la concentración de Hb (Hemocue) a partir de un pinchazo en el dedo.

Día de la recurrencia de P.vivax: Si se confirma la recurrencia, se tomará otra muestra de sangre venosa antes de la administración del tratamiento de rescate. Se colocarán 100 μl de esta sangre venosa en papel de filtro para determinar la concentración de CQ en sangre, y el resto se utilizará para el ensayo ex vivo y la criopreservación, como se detalla en el Anexo VI-C.

3.5.4 Violaciones del protocolo de pérdida de seguimiento La pérdida de seguimiento ocurre cuando, a pesar de todos los esfuerzos razonables, un paciente inscrito no asiste a las visitas programadas y no se puede encontrar. No se asignará ningún resultado del tratamiento a estos pacientes. Estos pacientes serán clasificados como perdidos de seguimiento y censurados o excluidos del análisis.

Los pacientes del estudio que cumplan con alguno de los siguientes criterios se clasificarán como retirados: i) retiro del consentimiento; ii) falta de completar el tratamiento; iii) eventos adversos graves que requieren la terminación del tratamiento antes de que se complete el curso completo; iv) violación de inscripción; v) violación del protocolo voluntario; vi) violación involuntaria del protocolo

3.5.5 Procedimientos de laboratorio y evaluación Microscopía Se deben obtener tres portaobjetos (frotis de sangre finos/gruesos) en la selección, uno se tiñe rápidamente (10% Giemsa durante 10 min) para examinar en un número limitado de campos para asegurar la presencia de formas asexuales de P.vivax a una parasitemia mínima de 250/ul. Una vez que el paciente esté inscrito, los otros dos portaobjetos se teñirán con más cuidado (3 % de Giemsa durante 45 min). La densidad se expresará como el número de parásitos asexuales por µl de sangre y se calculará dividiendo el número de parásitos asexuales por el número de glóbulos blancos contados y corregidos por la densidad estimada de glóbulos blancos (típicamente 8000 por µl). Cuando el recuento de parásitos asexuales es inferior a 10 por 200 glóbulos blancos, el recuento se realizará contra al menos 500 glóbulos blancos. Un frotis de sangre se considerará negativo cuando el examen de 1000 glóbulos blancos no revele parásitos asexuales.

• Parasitemia en estadio anular: El número de estadios anulares se contará en todos los portaobjetos positivos en el día 0 y en el día de recurrencia contra 200 parásitos asexuales; solo se utilizarán para el ensayo de fármacos ex vivo los aislados en los que la proporción de estadios anulares supere el 65 %.
• Gametocitos: la densidad se calculará contando el número de gametocitos por 500 glóbulos blancos.

Niveles de hemoglobina Los niveles de Hb se medirán en sangre completa recolectada en microcubetas usando Hemocue siguiendo las instrucciones del fabricante.

Medición de la concentración de CQ en el día 7 y el día de la recurrencia a partir de 100 µl de sangre expulsada en papel de cromatografía (31ETCHR, Whatman) La detección molecular del parásito y el genotipado del ADN se extraerán en ITM/NIMPE a partir de muestras de sangre por punción digital recolectadas en microtainers. La confirmación molecular de las especies de Plasmodium en el día 0 se realizará mediante qPCR dirigida al gen ribosomal 18S. Se utilizará el mismo método de qPCR para identificar y cuantificar las infecciones por P. vivax en el día 0 y las muestras de seguimiento.

Los genotipos de P. vivax se identificarán mediante la amplificación por PCR de 3 marcadores particularmente efectivos para la toma de huellas dactilares en ensayos clínicos (MS16, Pv3.2 y msp1F3), seguida de electroforesis en gel capilar.

Extracción de ARN y RT-qPCR para gametocitos El ARN se extraerá de muestras de RNAprotect en ITM/NIMPE utilizando columnas de afinidad y digestión con ADNsa del ADN genómico. Para detectar y cuantificar las etapas de gametocitos de P. vivax, se realizará una qPCR de transcripción inversa (RT-qPCR) dirigida a las transcripciones del gen Pvs25 en D0 y en todas las muestras de seguimiento.

Análisis de laboratorio de farmacorresistencia (Día 0 y de recurrencia) En breve, se centrifugará la sangre y se almacenará el plasma a -20ºC. La parte superior de la capa leucocítica se retirará con cuidado y se almacenará a -20ºC. Los glóbulos rojos (RBC) se resuspenderán en PBS (1:1) y los leucocitos se reducirán utilizando columnas de celulosa (Sigma). Las células filtradas se lavarán y el sedimento se medirá antes de resuspender al 50 % de hematocrito en medio McCoy (mezcla de medio de sangre, BMM, 4 ml).

Ensayos de sensibilidad a fármacos ex vivo: Brevemente, se prepararán placas con diluciones dobles de 7 puntos predosificados de CQ, PPQ, DHA y quinina siguiendo los procedimientos de WWARN [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Las concentraciones inhibitorias mínimas y la IC50 se calcularán utilizando la herramienta de análisis e informes in vitro (IVART) desarrollada en línea por WWARN.

Prueba de deficiencia de G6PD: a todos los pacientes se les realizará una prueba de deficiencia de G6PD mediante la prueba en el punto de atención de CareStart (Access Bio, Nueva Jersey, EE. UU.) antes del tratamiento con PQ.

4. Las visitas de monitoreo del sitio de control de calidad se programarán periódicamente. Durante estas visitas, la información registrada en los formularios de informes de casos se verificará con los documentos originales. Después de cotejar los formularios de informes de casos al final del juicio, se revisarán para verificar que estén completos y precisos. Los datos se ingresarán dos veces en una base de datos electrónica, donde se utilizan controles informáticos especialmente diseñados para identificar violaciones de protocolo seleccionadas y errores de datos.

Todos los frotis de sangre al ingreso serán leídos en el sitio del estudio, así como por un microscopista senior en un centro de coordinación. Además, se realizará un control de calidad externo en el ITM al 10% de los portaobjetos seleccionados aleatoriamente. Para cada uno de los ensayos moleculares (qPCR, RT-qPCR y genotipado de parásitos), el 10 % de las muestras procesadas en NIMPE se elegirán aleatoriamente para volver a analizarlas en ITM. El control de calidad externo de los resultados de los ensayos de fármacos ex vivo se realizará en ITM, donde se volverán a examinar los portaobjetos para el 10 % de los aislamientos elegidos al azar.

5. Plan analítico estadístico El análisis de la tasa de curación del día 42 se realizará tanto para la población de pacientes con intención de tratar (ITT) como para la población de pacientes evaluables (por protocolo). Los análisis de datos se realizarán utilizando el software STATA 12. Para las variables categóricas se calcularán los porcentajes y sus correspondientes intervalos de confianza del 95% siguiendo el método de Wilson. Las proporciones se compararán calculando el *2 con la corrección de Yates o mediante la prueba exacta de Fisher, según corresponda. Los datos continuos distribuidos normalmente se compararán mediante la prueba t de Student y el análisis de varianza. Los datos que no se ajusten a una distribución normal se compararán mediante la prueba U de Mann-Whitney o el análisis de varianza de Kruskal-Wallis. La correlación entre 2 variables continuas se evaluará utilizando el coeficiente de correlación de rangos de Pearson o Spearman según sea necesario.

El riesgo general de fracaso del tratamiento el día 28 y el día 42 se calculará mediante el método de Kaplan Meier, y las comparaciones entre los grupos de riesgo se realizarán mediante la prueba de rango logarítmico. El riesgo ajustado por PCR en los días 28 y 42 también se calculará siguiendo los resultados del genotipado de cada infección recurrente por P.vivax. El tiempo y la tasa de eliminación de parásitos se estimarán utilizando la herramienta en línea PCE desarrollada por WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). La media de IC50 y IC90 para CQ se estimará utilizando la herramienta de análisis e informes in vitro (IVART) desarrollada por WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

Los cambios hematológicos se evaluarán midiendo los cambios en la concentración de Hb entre los días 0, 3, 7, 14, 28 y 42, respectivamente.

6. Cuestiones éticas 6.1 La autorización ética para realizar el estudio se habrá obtenido del Comité de Ética del NIMPE, Hanoi y del Comité de Ética de la Universidad de Amberes, así como de la Junta de Revisión Institucional del ITM, Anwerp.

6.2 Proceso de consentimiento Los pacientes serán incluidos en el estudio solo si ellos (o los padres o tutores de los niños) dan su consentimiento informado. La solicitud de consentimiento está disponible en inglés y traducida al vietnamita para ser leída en su totalidad al paciente, padre o tutor. Se explicarán los detalles sobre el ensayo y sus beneficios y riesgos potenciales. Una vez respondidas las preguntas, se solicitará una firma en el documento. Si el paciente es analfabeto, debe firmar un testigo alfabetizado; si es posible, el firmante será seleccionado por el participante y no tendrá conexión con el equipo de investigación.