A klorokin hatékonyságának értékelése a Plasmodium Vivax fertőzések kezelésében Közép-Vietnamban

3.1 A vizsgálat felépítése Ezt a vizsgálatot egy 42 napos gyógyszerhatékonysági vizsgálatnak tervezték a P. vivax malária fertőzések kezelését követő klinikai és parazitológiai válaszok értékelésére. A vizsgálati kritériumoknak megfelelő P. vivax monofertőzésben szenvedő, tüneti betegeket bevonják a vizsgálatba, és CQ-val kezelik őket (teljes dózis 25 g/kg 3 napon keresztül). A kezelést közvetlenül megfigyelik, és a betegeket 42 napon keresztül aktívan követik a WHO kiterjesztett protokollja szerint. A követési idő végén minden beteget primakinnal kezelnek a P. vivax fertőzések radikális gyógyítására vonatkozó nemzeti irányelvek szerint.

3.2 A vizsgálat helye és populációja A vizsgálatot a Gia Lai tartomány Krong Pa körzetében végezzük, ahol a P. falciparum és a P. vivax malária előfordulása a legmagasabbak között van az országban. A tanulmány a Chu'R Cam kommunában lesz, ahol a kutatócsoport a helyi egészségügyi személyzettel és az összes környező településen dolgozik majd, ahol maláriás betegek élnek.

A helyi lakosságot túlnyomórészt a jaRai etnikai kisebbség alkotja, és fő foglalkozása a vágás és égetés (főleg a kukorica, a manióka és a rizs) erdei szántóföldeken, valamint a gumiültetvényeken végzett szezonális munka, valamint a napi áruk kisüzemi termelése. megélhetés vagy kereskedelem pl. kávé és kesudió. Az éghajlat trópusi, a száraz évszak novembertől áprilisig, az esős évszak pedig májustól októberig tart. A terület dombos és erdős (másodlagos erdő), és a malária fő hordozója az Anopheles dirus.

3.4 Vizsgálati populáció A célpopuláció magában foglalja az összes P.vivax-fertőzött beteget (gyermekek és felnőttek), akik vagy spontán jelentkeznek a CHC-nél, vagy akiket a közösségben végzett aktív szűréssel azonosítottak.

3.5. Vizsgálati eljárások 3.5.1. Szűrés és toborzás Minden olyan konzultáns betegnek, aki a szűrés során megfelel az alapvető felvételi kritériumoknak, egy egymást követő szűrési számot rendel, és az orvos alaposabban értékeli. Amint a beteg megfelel az összes felvételi kritériumnak, beleegyezését kell kérni tőle (vagy gyermek esetén a szülőtől vagy gyámtól) a vizsgálatban való részvételhez. Ezután kap egy tanulmányi számot (azonosító = sorszámozás). Minden olyan személyt, aki úgy dönt, hogy nem vesz részt a vizsgálatban, az egészségügyi intézmény személyzete megvizsgálja, kezeli és nyomon követi az Egészségügyi Minisztérium által meghatározott ellátási színvonalnak megfelelően.

A beiratkozáskor (0. nap) a pácienst megvizsgálják, és szabványos, előre kódolt kérdőívet töltenek ki. A vénás vérmintát EDTA-t vagy savas-citrát-dextrózt (EDTA/ACD) tartalmazó steril vacutainer csövekbe veszik a felvételkor minden betegtől. Felnőttektől minimum 5 ml - maximum 8 ml - vért, gyermekektől 1 ml/kg-ot 5 ml-ig. Két vércseppet csepegtetünk egy 1,5 ml-es csőbe, amely 500 µl RNAprotect reagenst (Qiagen) tartalmaz.

3.5.2 Kezelés Minden beteg teljes körű CQ-kezelést kap, 25 mg CQ-bázis/testtömeg-kg dózisban, 3 napon keresztül, közvetlen felügyelet mellett. A betegeket a kezelés után 60 percig megfigyelik mellékhatások vagy hányás szempontjából. Azok a betegek, akik az első 30 percben hányták a gyógyszerüket, ismételt teljes adagot kapnak; a 30-60 perctől hányók fél adagot kapnak. Ha a beteg ismét hány, visszavonják, és mentőterápiát ajánlanak fel.

Mentőgyógyszer:

Orális = CQ (3 nap, 25 mg/kg) primakinnal együtt (0,25 mg/kg/nap 14 napig); Intravénás (IV) = Artesunate (4 mg/ttkg/nap) legalább 24 órán keresztül, amíg a beteg nem tudja bevenni az orális gyógyszert. Ezután folytassa az orális DHA-PPQ-val 3 napig.

Radikális gyógymód. A primaquine-kezelést elhalasztják a követés végéig, és a nemzeti irányelvek ajánlása szerint, azaz 0,25 mg/ttkg/nap 14 napon át minden negatív G6PD gyorsteszttel rendelkező betegnek adják.

3.5.3 Nyomon követés A 0. naptól a parazita kiürüléséig a betegeket 12 óránként vérmikroszkóppal ellenőrizni kell, legalább a 3. napig, és szükség esetén tovább, amíg a parazita kiürülését két egymást követő negatív tárgylemezként határozzák meg.

Minden vizit alkalmával a pácienst meginterjúvolják és megvizsgálják, és ujjszúrásos vérmintát vesznek a következő eredményekhez: két vérlemez LM megfigyeléshez (vastag és vékony film), 200 μl vér EDTA/ACD mikrotainer csőben DNS-hez. extrakciót, és 2 csepp vért egy másik mikrotainer csőbe, amely RNAprotect-et tartalmaz az RNS extrakcióhoz. A 3. napon további csepp vért vesznek a Hb-koncentráció mérésére Hemocue módszerrel.

7., 14., 21., 28., 35., 42. nap A betegeket megkérdezik és megvizsgálják, kitöltik a nyomon követési űrlapot, és dokumentálnak minden nemkívánatos eseményt. Ujjszúrásos vérmintát veszünk a következő eredményekhez: két vérlemez LM megfigyeléshez (vastag és vékony film), 200 μl vér EDTA/ACD mikrotainer csőben a DNS-kivonáshoz, és 2 csepp vér RNAprotect-et tartalmazó mikrotainer csőben .

Ezenkívül a 7. napon 100 μl vért veszünk szűrőpapírra a vér CQ-koncentrációjának meghatározására. A 7., 14., 28. és 42. napon a Hb-koncentrációt (Hemocue) az ujjszúrással mérik.

A P. vivax kiújulásának napja: Ha a kiújulás beigazolódik, további vénás vérmintát vesznek a mentőkezelés beadása előtt. Ebből a vénás vérből 100 μl-t szűrőpapírra tesznek a vér CQ-koncentrációjának meghatározására, a fennmaradó részt ex vivo vizsgálathoz és mélyhűtéshez használják fel a VI-C. mellékletben részletezettek szerint.

3.5.4 Veszteség a nyomon követési protokoll megsértése miatt Az utánkövetés elvesztése akkor következik be, ha minden ésszerű erőfeszítés ellenére a beíratott beteg nem jelenik meg a tervezett viziteken, és nem található. Ezekhez a betegekhez nem rendelnek hozzá kezelési eredményt. Ezeket a betegeket a nyomon követés miatt elveszettnek minősítik, és cenzúrázzák vagy kizárják az elemzésből.

Azok a vizsgálati betegek, akik megfelelnek az alábbi kritériumok bármelyikének, visszavontnak minősülnek: i) a beleegyezés visszavonása; ii) a kezelés befejezésének elmulasztása; iii. súlyos nemkívánatos események, amelyek miatt a kezelést a teljes kúra befejezése előtt meg kell szakítani; iv) beiratkozási szabálysértés; v) önkéntes protokollsértés; vi) akaratlan protokollsértés

3.5.5 Laboratóriumi eljárások és értékelés Mikroszkópia A szűréskor három lemezt (vékony/vastag vérkenet) kell venni, az egyiket gyorsan meg kell festeni (10% Giemsa 10 percig), hogy korlátozott számú területen megvizsgálhassuk a P. vivax ivartalan formáinak jelenlétét. minimum 250/ul parazitaemia esetén. Miután a pácienst bevonták, a másik két tárgylemezt alaposabban megfestik (3% Giemsa 45 percig). A sűrűséget az aszexuális paraziták száma µl vérre vetítve fejezzük ki, és az aszexuális paraziták számát elosztjuk a megszámlált és a becsült WBC-sűrűséggel (jellemzően 8000/µl) korrigált WBC-k számával. Ha az aszexuális parazitaszám kevesebb, mint 10/200 fehérvérsejt, akkor a számlálást legalább 500 fehérvérsejthez képest kell elvégezni. A vérlemez akkor tekinthető negatívnak, ha 1000 fehérvérsejt vizsgálata nem tár fel aszexuális parazitákat.

• Gyűrűs stádiumú parazitaemia: A gyűrűs stádiumok számát minden pozitív tárgylemezen megszámolják a 0. napon és a kiújulás napján 200 aszexuális parazitával szemben; csak azokat az izolátumokat használják az ex vivo gyógyszervizsgálathoz, amelyeknél a gyűrűs stádiumok aránya meghaladja a 65%-ot.
• Gametociták: a sűrűséget úgy számítjuk ki, hogy megszámoljuk az 500 WBC-nkénti gametociták számát.

Hemoglobinszintek A Hb-szinteket a mikroküvettába gyűjtött teljes véren mérik a Hemocue segítségével a gyártó utasításait követve.

A CQ-koncentráció mérése a 7. napon és a kiújulás napján 100 µl vérből kromatográfiás papírra (31ETCHR, Whatman) A paraziták molekuláris kimutatására és genotipizálására szolgáló DNS-t az ITM/NIMPE-ben vonják ki a mikrotainerekben gyűjtött ujjszúrt vérmintákból. A Plasmodium fajok molekuláris megerősítését a 0. napon a 18S riboszomális gént megcélzó qPCR-rel végezzük. Ugyanezt a qPCR-módszert fogják használni a P. vivax fertőzések azonosítására és számszerűsítésére a 0. napon, valamint a minták nyomon követésére.

A P. vivax genotípusok azonosítása három marker PCR-amplifikációjával történik, amelyek különösen hatékonyak az ujjlenyomat-vételre a klinikai vizsgálatok során (MS16, Pv3.2 és msp1F3), majd kapilláris gélelektroforézissel.

RNS extrakció és RT-qPCR a gametocitákhoz Az RNS-t az RNAprotect mintákból az ITM/NIMPE-nél affinitásoszlopok és a genomiális DNS DNS-áz emésztése segítségével vonják ki. A P. vivax gametocita stádiumainak kimutatására és mennyiségi meghatározására reverz transzkripciós qPCR-t (RT-qPCR) végeznek, amely a Pvs25 gén transzkriptumát célozza meg a 0. napon és az összes követési mintában.

Gyógyszerrezisztencia laboratóriumi elemzése (0. nap és a kiújulás) Röviden, a vért centrifugálják, és a plazmát -20°C-on tárolják. A buffy coat felső részét óvatosan eltávolítjuk és -20°C-on tároljuk. A vörösvértesteket (RBC) újraszuszpendálják PBS-ben (1:1), és a leukocitákat cellulózoszlopok (Sigma) segítségével ürítik ki. A leszűrt sejteket mossuk, és a pelletet mérjük, mielőtt újraszuszpendáljuk 50%-os hematokrit mellett McCoy tápközegben (vértápközeg keverék, BMM, 4 ml).

Ex vivo gyógyszerérzékenységi vizsgálatok: Röviden összefoglalva, a CQ, PPQ, DHA és kinin 7 pontos, kétszeres hígításait tartalmazó lemezeket a WWARN-eljárásokat követve készítjük el [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. A minimális gátló koncentrációkat és az IC50-et a WWARN által online kifejlesztett In Vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) segítségével számítják ki.

G6PD-hiányteszt: a PQ-kezelés előtt minden betegnél megvizsgálják a G6PD-hiányt a CareStart (Access Bio, New Jersey, USA) pont-of-care tesztje segítségével.

4. Minőségbiztosítási helyszíni megfigyelési látogatásokat rendszeresen ütemeznek. E látogatások során az esetjelentési űrlapokon rögzített információkat a forrásdokumentumok alapján ellenőrzik. Miután a tárgyalás végén összegyűjtötték az esetjelentési űrlapokat, felülvizsgálják azok teljességét és pontosságát. Az adatok kétszer kerülnek be egy elektronikus adatbázisba, ahol speciálisan kialakított számítógépes ellenőrzések segítségével azonosítják a kiválasztott protokollsértéseket és adathibákat.

A felvételkor felvett összes vérfilmet a vizsgálat helyszínén, valamint a koordinációs központ vezető mikroszkópos szakembere fogja felolvasni. Ezenkívül a véletlenszerűen kiválasztott diák 10%-án külső minőségellenőrzést végeznek az ITM-nél. Minden egyes molekuláris vizsgálathoz (qPCR, RT-qPCR és parazita genotipizálás) a NIMPE-nél feldolgozott minták 10%-át véletlenszerűen választják ki az ITM-en történő újraelemzésre. Az ex vivo gyógyszervizsgálati eredmények külső minőségellenőrzésére az ITM-ben kerül sor, ahol a lemezeket újra megvizsgálják a véletlenszerűen kiválasztott izolátumok 10%-ára.

5. Statisztikai analitikai terv A 42. napi gyógyulási arány elemzését mind a kezelési szándékú (ITT) betegpopulációra, mind az értékelhető betegpopulációra vonatkozóan (Protokollonként) elvégzik. Az adatok elemzése a STATA 12 szoftverrel történik. Kategorikus változók esetén a százalékok és a megfelelő 95%-os konfidencia intervallumok kiszámítása a Wilson-módszer szerint történik. Az arányokat úgy kell összehasonlítani, hogy a *2-t Yates korrekciójával vagy Fisher-féle pontos teszttel kell kiszámítani, ahol ez szükséges. A normál eloszlású folytonos adatokat Student-féle t-próbával és varianciaanalízissel hasonlítjuk össze. A normális eloszlásnak nem megfelelő adatokat a Mann-Whitney U teszt vagy a Kruskal-Wallis varianciaanalízis hasonlítja össze. A 2 folytonos változó közötti korrelációt szükség szerint Pearson vagy Spearman rangkorrelációs együtthatójával kell értékelni.

A kezelés sikertelenségének teljes kockázatát a 28. és a 42. napra a Kaplan Meier módszerrel számítják ki, és a kockázati csoportok összehasonlítását a log rank teszt segítségével végezzük. A PCR-rel korrigált kockázatot a 28. és 42. napon szintén kiszámítjuk az egyes visszatérő P. vivax fertőzések genotipizálási eredményei alapján. A paraziták kiürülési idejét és sebességét a WWARN által kifejlesztett PCE online eszköz segítségével becsülik meg (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). A CQ átlagos IC50 és IC90 értékét a WWARN által kifejlesztett In vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) segítségével becsülik meg (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

A hematológiai változásokat a Hb-koncentráció változásának mérésével értékelik a 0., 3., 7., 14., 28. és 42. nap között.

6. Etikai kérdések 6.1 A vizsgálat elvégzéséhez szükséges etikai engedélyt a NIMPE Hanoi Etikai Bizottsága és az Antwerpeni Egyetem Etikai Bizottsága, valamint az Anwerpeni ITM intézményi felülvizsgálati bizottsága biztosítja.

6.2 A beleegyezés folyamata A betegek csak akkor vehetők részt a vizsgálatban, ha ők (vagy a gyermekek szülei vagy gyámjai) tájékozott beleegyezést adnak. A beleegyezési kérelem angol nyelven áll rendelkezésre, és vietnami nyelvre is lefordítva, hogy teljes egészében felolvassa a beteg, a szülő vagy a gyám számára. A kísérlet részleteit, annak előnyeit és lehetséges kockázatait ismertetjük. A kérdések megválaszolása után aláírást kérnek a dokumentumon. Ha a beteg írástudatlan, írástudó tanúnak kell aláírnia; ha lehetséges, az aláírót a résztvevő választja ki, és nem lesz kapcsolata a kutatócsoporttal.