Bewertung der Wirksamkeit von Chloroquin zur Behandlung von Plasmodium-Vivax-Infektionen in Zentralvietnam

3.1 Studiendesign Diese Studie ist als 42-tägige Arzneimittelwirksamkeitsstudie konzipiert, um das klinische und parasitologische Ansprechen nach der Behandlung von P.vivax-Malariainfektionen zu bewerten. Symptomatische Patienten mit P. vivax-Monoinfektionen, die die Studienkriterien erfüllen, werden in die Studie aufgenommen und mit CQ (Gesamtdosis 25 g/kg über 3 Tage) behandelt. Die Behandlung wird direkt beobachtet und die Patienten werden 42 Tage lang gemäß einem erweiterten WHO-Protokoll aktiv nachbeobachtet. Am Ende der Nachbeobachtungszeit werden alle Patienten gemäß den nationalen Richtlinien zur radikalen Heilung von P.vivax-Infektionen mit Primaquin behandelt.

3.2 Studienort und Population Die Studie wird im Distrikt Krong Pa, Provinz Gia Lai, durchgeführt, wo sowohl die P.falciparum- als auch die P.vivax-Malariainzidenz zu den höchsten im Land gehört. Die Studie wird in der Gemeinde Chu'R Cam stattfinden, wo das Studienteam mit dem örtlichen Gesundheitspersonal und allen umliegenden Gemeinden mit Malariapatienten zusammenarbeiten wird.

Die lokale Bevölkerung besteht hauptsächlich aus der ethnischen Minderheit der JaRai und die Hauptbeschäftigung besteht aus Brandrodung (hauptsächlich Mais, Maniok und Reis) auf Waldfeldern, zusammen mit saisonaler Arbeit in Kautschukplantagen und der kleinen Produktion von Waren für den täglichen Bedarf Lebensunterhalt oder Gewerbe z.B. Kaffee und Cashewnüsse. Das Klima ist tropisch mit der Trockenzeit von November bis April und der Regenzeit von Mai bis Oktober. Das Gebiet ist hügelig und bewaldet (Sekundärwald) und der Hauptüberträger von Malaria ist Anopheles dirus.

3.4 Studienpopulation Die Zielpopulation umfasst alle P.vivax-infizierten Patienten (Kinder und Erwachsene), die sich entweder spontan im CHC vorstellen oder durch aktives Screening in der Gemeinde identifiziert wurden.

3.5 Studienverfahren 3.5.1 Screening und Rekrutierung Alle konsultierenden Patienten, die während des Screenings die grundlegenden Aufnahmekriterien erfüllen, erhalten eine fortlaufende Screening-Nummer und werden vom Arzt eingehender evaluiert. Sobald der Patient alle Aufnahmekriterien erfüllt, wird er oder sie (oder ein Elternteil oder Erziehungsberechtigter bei Kindern) um Zustimmung zur Teilnahme an der Studie gebeten. Anschließend wird ihm/ihr eine Studiennummer (ID=fortlaufende Nummerierung) zugeteilt. Jede Person, die sich entscheidet, nicht an der Studie teilzunehmen, wird vom Personal der Gesundheitseinrichtung gemäß dem vom Gesundheitsministerium festgelegten Versorgungsstandard untersucht, behandelt und nachbeobachtet.

Bei der Einschreibung (Tag 0) wird der Patient untersucht und ein standardisierter vorcodierter Fragebogen wird ausgefüllt. Bei der Einschreibung wird allen Patienten eine venöse Blutprobe in sterilen Vacutainer-Röhrchen mit EDTA oder Säure-Citrat-Dextrose (EDTA/ACD) entnommen. Bei Erwachsenen werden mindestens 5 ml Blut – und höchstens 8 ml – und bei Kindern 1 ml/kg bis zu 5 ml entnommen. Zwei Bluttropfen werden in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 µl RNAprotect-Reagenz (Qiagen) gegeben.

3.5.2 Behandlung Alle Patienten erhalten eine vollständige Behandlung mit CQ in einer Dosis von 25 mg CQ-Base pro kg Körpergewicht (KG) über 3 Tage und unter direkter Überwachung. Die Patienten werden nach der Behandlung 60 Minuten lang auf Nebenwirkungen oder Erbrechen beobachtet. Patienten, die ihr Medikament innerhalb der ersten 30 Minuten erbrechen, erhalten eine wiederholte volle Dosis; diejenigen, die nach 30-60 Minuten erbrechen, erhalten die halbe Dosis. Wenn der Patient erneut erbricht, wird er zurückgezogen und eine Rettungstherapie angeboten.

Rettungsmedikamente:

Oral = CQ (3 Tage, 25 mg/kg) zusammen mit Primaquin (0,25 mg/kg/Tag für 14 Tage); Intravenös (IV) = Artesunat (4 mg/kg/Tag) für mindestens 24 Stunden und bis der Patient das Medikament oral einnehmen kann. Fahren Sie dann mit oralem DHA-PPQ für 3 Tage fort.

Radikale Heilung. Die Behandlung mit Primaquin wird bis zum Ende der Nachsorge verschoben und wie von den nationalen Richtlinien empfohlen verabreicht, d. h. 0,25 mg/kg/Tag für 14 Tage an alle Patienten mit negativem G6PD-Schnelltest.

3.5.3 Nachsorge Von Tag 0 bis zur Beseitigung der Parasiten werden die Patienten alle 12 Stunden blutmikroskopisch überwacht, mindestens bis Tag 3 und länger, falls erforderlich, bis zur Beseitigung der Parasiten, definiert als zwei aufeinanderfolgende negative Objektträger.

Bei jedem Besuch wird der Patient befragt und untersucht, und es wird eine Blutprobe aus dem Finger entnommen, um die folgenden Ergebnisse zu erzielen: zwei Blutschnitte für die LM-Beobachtung (dicker und dünner Film), 200 μl Blut in einem EDTA/ACD-Microtainer-Röhrchen für DNA Extraktion und 2 Tropfen Blut in ein anderes Microtainer-Röhrchen mit RNAprotect für die RNA-Extraktion. An Tag 3 wird ein zusätzlicher Blutstropfen entnommen, um die Hb-Konzentration mit der Hemocue-Methode zu messen.

Tag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Die Patienten werden befragt und untersucht, das Nachsorgeformular wird ausgefüllt und alle unerwünschten Ereignisse werden dokumentiert. Für die folgenden Ergebnisse wird eine Blutprobe aus der Fingerkuppe entnommen: zwei Blutschnitte für die LM-Beobachtung (Dick- und Dünnfilm), 200 μl Blut in einem EDTA/ACD-Microtainer-Röhrchen für die DNA-Extraktion und 2 Tropfen Blut in einem RNAprotect-enthaltenden Microtainer-Röhrchen .

Zusätzlich werden an Tag 7 100 μl Blut auf Filterpapier entnommen, um die CQ-Konzentration im Blut zu bestimmen. An den Tagen 7, 14, 28 und 42 wird die Hb-Konzentration (Hemocue) durch Fingerstich gemessen.

Tag des Wiederauftretens von P.vivax: Wenn ein Wiederauftreten bestätigt wird, wird vor der Verabreichung der Notfallbehandlung eine weitere venöse Blutprobe entnommen. 100 μl dieses venösen Bluts werden auf Filterpapier getupft, um die CQ-Konzentration im Blut zu bestimmen, der Rest wird für Ex-vivo-Assays und Kryokonservierung verwendet, wie in Anhang VI-C beschrieben.

3.5.4 Verstöße gegen das Loss-to-Follow-up-Protokoll Ein „Loss-to-follow-up“ tritt auf, wenn ein angemeldeter Patient trotz aller angemessenen Bemühungen nicht an den geplanten Besuchen teilnimmt und nicht gefunden werden kann. Diesen Patienten wird kein Behandlungsergebnis zugeordnet. Diese Patienten werden als „lost to follow-up“ klassifiziert und zensiert oder von der Analyse ausgeschlossen.

Studienpatienten, die eines der folgenden Kriterien erfüllen, werden als zurückgezogen eingestuft: i) Widerruf der Einwilligung; ii) Nichtbeendigung der Behandlung; iii) schwerwiegende unerwünschte Ereignisse, die eine Beendigung der Behandlung erforderlich machen, bevor die vollständige Kur abgeschlossen ist; iv) Registrierungsverletzung; v) freiwilliger Protokollverstoß; vi) unfreiwillige Verletzung des Protokolls

3.5.5 Laborverfahren und Auswertung Mikroskopie Beim Screening sollten drei Objektträger (dünner/dicker Blutausstrich) entnommen werden, von denen einer schnell gefärbt wird (10 % Giemsa für 10 min), um ihn in einer begrenzten Anzahl von Feldern zu untersuchen, um das Vorhandensein asexueller Formen von P.vivax sicherzustellen bei einer minimalen Parasitämie von 250/ul. Sobald der Patient aufgenommen ist, werden die anderen beiden Objektträger sorgfältiger gefärbt (3 % Giemsa für 45 min). Die Dichte wird als Anzahl der asexuellen Parasiten pro ul Blut ausgedrückt und berechnet, indem die Anzahl der asexuellen Parasiten durch die Anzahl der gezählten WBCs dividiert und um die geschätzte WBCs-Dichte (typischerweise 8000 pro ul) korrigiert wird. Wenn die Anzahl der asexuellen Parasiten weniger als 10 pro 200 Leukozyten beträgt, wird die Zählung anhand von mindestens 500 Leukozyten durchgeführt. Ein Blutbild gilt als negativ, wenn die Untersuchung von 1000 Leukozyten keine asexuellen Parasiten zeigt.

• Parasitämie im Ringstadium: Die Anzahl der Ringstadien wird in allen positiven Objektträgern am Tag 0 und am Tag des Wiederauftretens gegen 200 asexuelle Parasiten gezählt; nur Isolate, bei denen der Anteil der Ringstadien 65 % übersteigt, werden für den Ex-vivo-Arzneimitteltest verwendet.
• Gametozyten: Die Dichte wird berechnet, indem die Anzahl der Gametozyten pro 500 Leukozyten gezählt wird.

Hämoglobinspiegel Die Hb-Spiegel werden anhand von Vollblut gemessen, das in einer Mikroküvette unter Verwendung von Hemocue gemäß den Anweisungen des Herstellers entnommen wird.

Messung der CQ-Konzentration an Tag 7 und am Tag des Rezidivs aus 100 µl Blut, das auf Chromatographiepapier (31ETCHR, Whatman) ausgestoßen wurde Molekularer Parasitennachweis und Genotypisierung DNA wird am ITM/NIMPE aus in Mikrobehältern entnommenen Blutproben aus der Fingerkuppe extrahiert. Die molekulare Bestätigung von Plasmodium-Spezies an Tag 0 wird durch qPCR durchgeführt, die auf das ribosomale 18S-Gen abzielt. Dieselbe qPCR-Methode wird zur Identifizierung und Quantifizierung von P. vivax-Infektionen an Tag 0 und zur Nachverfolgung von Proben verwendet.

P. vivax-Genotypen werden durch PCR-Amplifikation von 3 Markern identifiziert, die besonders effektiv für Fingerabdrücke in klinischen Studien (MS16, Pv3.2 und msp1F3) sind, gefolgt von Kapillargelelektrophorese.

RNA-Extraktion und RT-qPCR für Gametozyten RNA wird aus RNAprotect-Proben am ITM/NIMPE unter Verwendung von Affinitätssäulen und DNAse-Verdauung genomischer DNA extrahiert. Um P. vivax-Gametozytenstadien nachzuweisen und zu quantifizieren, wird am D0 und in allen Folgeproben eine reverse Transkriptions-qPCR (RT-qPCR) durchgeführt, die auf Pvs25-Gentranskripte abzielt.

Laboranalyse der Arzneimittelresistenz (Tag 0 und Rezidiv) Kurz gesagt wird das Blut zentrifugiert und das Plasma bei -20 °C gelagert. Der obere Teil des Buffy Coat wird vorsichtig entfernt und bei -20 °C gelagert. Rote Blutkörperchen (RBCs) werden in PBS (1:1) resuspendiert und Leukozyten werden unter Verwendung von Zellulosesäulen (Sigma) abgereichert. Die filtrierten Zellen werden gewaschen und das Pellet gemessen, bevor sie bei 50 % Hämatokrit in McCoy-Medium (Blutmediummischung, BMM, 4 ml) resuspendiert werden.

Ex-vivo-Arzneimittelsensitivitätsassays: Kurz gesagt, Platten mit vordosierten 7-Punkt-2-fach-Verdünnungen von CQ, PPQ, DHA und Chinin werden gemäß WWARN-Verfahren [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Die minimalen Hemmkonzentrationen und der IC50-Wert werden mithilfe des von WWARN online entwickelten In-vitro-Analyse- und Berichtstools (IVART) berechnet.

G6PD-Mangeltest: Alle Patienten werden vor der PQ-Behandlung mit dem Point-of-Care-Test von CareStart (Access Bio, New Jersey, USA) auf G6PD-Mangel getestet.

4. Qualitätssicherungsbesuche vor Ort werden regelmäßig geplant. Während dieser Besuche werden die in den Fallberichtsformularen aufgezeichneten Informationen anhand von Quelldokumenten überprüft. Nachdem die Fallberichtsformulare am Ende der Studie zusammengestellt wurden, werden sie auf Vollständigkeit und Richtigkeit überprüft. Die Daten werden doppelt in eine elektronische Datenbank eingegeben, in der speziell entwickelte Computerprüfungen verwendet werden, um ausgewählte Protokollverletzungen und Datenfehler zu identifizieren.

Alle Blutausstriche bei der Aufnahme werden am Studienort sowie von einem erfahrenen Mikroskopiker in einem koordinierenden Zentrum gelesen. Zusätzlich wird bei 10 % der zufällig ausgewählten Objektträger eine externe Qualitätskontrolle am ITM durchgeführt. Für jeden der molekularen Assays (qPCR, RT-qPCR und Parasiten-Genotypisierung) werden 10 % der bei NIMPE verarbeiteten Proben nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, um bei ITM erneut analysiert zu werden. Eine externe Qualitätskontrolle der Ergebnisse von Ex-vivo-Arzneimitteltests wird am ITM durchgeführt, wo die Objektträger erneut auf 10 % der zufällig ausgewählten Isolate untersucht werden.

5. Statistischer Analyseplan Die Analyse der Heilungsrate an Tag 42 wird sowohl für die Intention-to-Treat (ITT)-Patientenpopulation als auch für die auswertbare Patientenpopulation (Per Protocol) durchgeführt. Datenanalysen werden mit der Software STATA 12 durchgeführt. Für kategoriale Variablen werden Prozentsätze und entsprechende 95 %-Konfidenzintervalle nach der Methode von Wilson berechnet. Die Anteile werden verglichen, indem *2 mit der Yates-Korrektur oder gegebenenfalls mit dem exakten Test von Fisher berechnet wird. Normalverteilte kontinuierliche Daten werden mit Student's t-Test und Varianzanalyse verglichen. Daten, die keiner Normalverteilung entsprechen, werden mit dem Mann-Whitney-U-Test oder der Kruskal-Wallis-Varianzanalyse verglichen. Die Korrelation zwischen 2 kontinuierlichen Variablen wird je nach Bedarf entweder mit dem Rangkorrelationskoeffizienten nach Pearson oder nach Spearman bewertet.

Das Gesamtrisiko eines Behandlungsversagens an Tag 28 und an Tag 42 wird nach der Kaplan-Meier-Methode berechnet, und Vergleiche zwischen Risikogruppen werden unter Verwendung des Log-Rank-Tests durchgeführt. Das PCR-bereinigte Risiko an Tag 28 und 42 wird auch nach den Genotypisierungsergebnissen jeder wiederkehrenden P.vivax-Infektion berechnet. Zeit und Rate der Parasitenbeseitigung werden mit dem von WWARN entwickelten PCE-Online-Tool (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator) geschätzt. Die mittleren IC50 und IC90 für CQ werden unter Verwendung des von WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart) entwickelten In-vitro-Analyse- und Berichtstools (IVART) geschätzt.

Hämatologische Veränderungen werden durch Messen der Veränderungen der Hb-Konzentration zwischen Tag 0, 3, 7, 14, 28 bzw. 42 bewertet.

6. Ethische Fragen 6.1 Die ethische Genehmigung zur Durchführung der Studie wurde von der Ethikkommission des NIMPE, Hanoi und der Ethikkommission der Universität Antwerpen sowie vom Institutional Review Board des ITM, Antwerpen, eingeholt.

6.2 Zustimmungsprozess Patienten werden nur dann in die Studie aufgenommen, wenn sie (oder Eltern oder Erziehungsberechtigte von Kindern) ihre informierte Zustimmung geben. Der Zustimmungsantrag ist auf Englisch verfügbar und wird ins Vietnamesische übersetzt, damit er dem Patienten, Elternteil oder Erziehungsberechtigten vollständig vorgelesen werden kann. Einzelheiten über die Studie und ihre Vorteile und potenziellen Risiken werden erläutert. Sobald alle Fragen beantwortet sind, wird eine Unterschrift auf dem Dokument angefordert. Wenn der Patient Analphabet ist, muss ein schriftkundiger Zeuge unterschreiben; wenn möglich, wird der Unterzeichner vom Teilnehmer ausgewählt und hat keine Verbindung zum Forschungsteam.