Klorokiinin tehokkuuden arviointi Plasmodium Vivax -infektioiden hoidossa Keski-Vietnamissa

3.1 Tutkimuksen suunnittelu Tämä tutkimus on suunniteltu 42 päivän lääkkeen tehokkuuden tutkimukseksi kliinisten ja parasitologisten vasteiden arvioimiseksi P.vivax-malariainfektioiden hoidon jälkeen. Oireiset potilaat, joilla on P. vivax -monoinfektioita, jotka täyttävät tutkimuksen kriteerit, otetaan mukaan tutkimukseen ja heitä hoidetaan CQ:lla (kokonaisannos 25 gm/kg 3 päivän aikana). Hoitoa seurataan suoraan ja potilaita seurataan aktiivisesti 42 päivän ajan WHO:n laajennetun protokollan mukaisesti. Seurantaajan lopussa kaikkia potilaita hoidetaan primakiinilla noudattaen kansallisia ohjeita P.vivax-infektioiden radikaalista parantamisesta.

3.2 Tutkimuspaikka ja populaatio Tutkimus suoritetaan Krong Pa -alueella, Gia Lain maakunnassa, jossa sekä P.falciparum- että P.vivax-malarian ilmaantuvuus on maan korkeimpia. Tutkimus sijoitetaan Chu'R Camin kunnassa, jossa tutkimusryhmä työskentelee paikallisen terveydenhuollon henkilöstön ja kaikkien ympäröivien kuntien kanssa, joilla on malariapotilaita.

Paikallinen väestö koostuu pääosin JaRai-etnisestä vähemmistöstä, ja pääelinkeinona on leikata ja polttaa maataloutta (pääasiassa maissia, maniokkia ja riisiä) metsäpelloilla, kausityötä kumiviljelmillä sekä pientuotantoa päivittäiseen käyttöön. toimeentulo tai kauppa esim. kahvia ja cashewpähkinöitä. Ilmasto on trooppinen ja kuiva kausi on marraskuusta huhtikuuhun ja sadekausi toukokuusta lokakuuhun. Alue on mäkinen ja metsäinen (toissijainen metsä) ja pääasiallinen malarian levittäjä on Anopheles dirus.

3.4 Tutkimuspopulaatio Kohdepopulaatio sisältää kaikki P.vivax-tartunnan saaneet potilaat (lapset ja aikuiset), jotka joko esiintyvät spontaanisti CHC:ssä tai jotka on tunnistettu aktiivisella seulonnalla yhteisössä.

3.5 Koemenettelyt 3.5.1 Seulonta ja rekrytointi Kaikille konsultoiville potilaille, jotka täyttävät seulonnan aikana rekisteröinnin peruskriteerit, määrätään peräkkäinen seulontanumero, ja lääkäri arvioi ne perusteellisemmin. Kun potilas täyttää kaikki ilmoittautumiskriteerit, häneltä (tai lapsen vanhemmalta tai huoltajalta) pyydetään suostumus tutkimukseen osallistumiseen. Sitten hänelle jaetaan opintonumero (ID = järjestysnumerointi). Henkilö, joka päättää olla osallistumatta tutkimukseen, tulee terveyskeskuksen henkilökunnan tarkastukseen, hoitoon ja seurantaan terveysministeriön asettaman hoitostandardin mukaisesti.

Ilmoittautumisen yhteydessä (päivä 0) potilas tutkitaan ja täytetään standardoitu esikoodattu kyselylomake. Laskimoverinäytteet kerätään kaikilta ilmoittautuneilta potilailta steriileihin vacutainer-putkiin, jotka sisältävät EDTA:ta tai happo-sitraatti-dekstroosia (EDTA/ACD). Aikuisilta kerätään vähintään 5 ml ja enintään 8 ml verta ja lapsilta 1 ml/kg enintään 5 ml. Kaksi veritippaa lisätään 1,5 ml:n putkeen, joka sisältää 500 µl RNAprotect-reagenssia (Qiagen).

3.5.2 Hoito Kaikki potilaat saavat täyden CQ-hoidon annoksella 25 mg CQ-emästä painokiloa (bw) kohti annettuna kolmen päivän aikana ja suorassa valvonnassa. Potilaita tarkkaillaan 60 minuutin ajan hoidon jälkeen haittavaikutusten tai oksentelun varalta. Potilaat, jotka oksentavat lääkityksensä ensimmäisten 30 minuutin aikana, saavat toistuvan täyden annoksen; ne, jotka oksentavat 30-60 minuuttia, saavat puolet annoksesta. Jos potilas oksentaa uudelleen, hänet vedetään pois ja hänelle tarjotaan pelastushoitoa.

Pelastuslääkitys:

Suun kautta = CQ (3 päivää, 25 mg/kg) yhdessä primakiinin kanssa (0,25 mg/kg/päivä 14 päivän ajan); Laskimonsisäinen (IV) = artesunaatti (4 mg/kg/vrk) vähintään 24 tuntia ja kunnes potilas pystyy ottamaan suun kautta otettavaa lääkettä. Jatka sitten oraalista DHA-PPQ:ta 3 päivän ajan.

Radikaali hoito. Primaquine-hoitoa viivästetään seurannan loppuun asti ja annetaan kansallisten ohjeiden mukaisesti, eli 0,25 mg/kg/vrk 14 päivän ajan kaikille potilaille, joilla on negatiivinen G6PD-pikatesti.

3.5.3 Seuranta päivästä 0 loisten puhdistumiseen asti potilaita seurataan 12 tunnin välein verimikroskoopilla vähintään päivään 3 ja tarvittaessa kauemmin, kunnes loisen puhdistuma määritellään kahdeksi peräkkäiseksi negatiiviseksi objektilasiksi.

Jokaisella käynnillä potilasta haastatellaan ja tutkitaan ja sormenpistoverinäyte otetaan seuraavista tuloksista: kaksi verilevyä LM-havainnointia varten (paksu ja ohut kalvo), 200 μl verta EDTA/ACD-mikrotaineriputkessa DNA:ta varten. uutto ja 2 tippaa verta toiseen mikrotainerputkeen, joka sisältää RNAprotectia RNA:n uuttamista varten. Päivänä 3 otetaan ylimääräinen pisara verta Hb-pitoisuuden mittaamiseksi Hemocue-menetelmällä.

Päivät 7, 14, 21, 28, 35, 42 Potilaita haastatellaan ja tutkitaan, seurantalomake täytetään ja mahdolliset haittatapahtumat dokumentoidaan. Sormenpistoverinäyte otetaan seuraavia tuloksia varten: kaksi verilevyä LM-havainnointia varten (paksu ja ohut kalvo), 200 μl verta EDTA/ACD-mikrotainer-putkessa DNA:n erottamista varten ja 2 tippaa verta RNAprotectin sisältävässä mikrotainerputkessa .

Lisäksi päivänä 7 otetaan 100 μl verta suodatinpaperille veren CQ-konsentraation määrittämiseksi. Päivinä 7, 14, 28 ja 42 Hb-pitoisuus (Hemocue) mitataan sormenpistosta.

P.vivaxin uusiutumisen päivä: Jos uusiutuminen vahvistetaan, otetaan uusi laskimoverinäyte ennen pelastushoidon antamista. 100 μl tätä laskimoverta laitetaan suodatinpaperille veren CQ-konsentraation määrittämiseksi, loput käytetään ex vivo -määritykseen ja kylmäsäilytykseen liitteen VI-C mukaisesti.

3.5.4 Tappio seurantaprotokollarikkomuksista Seurannan menetys tapahtuu, kun kaikista kohtuullisista ponnisteluista huolimatta potilas ei tule paikalle eikä häntä löydy. Näille potilaille ei määrätä hoitotulosta. Nämä potilaat luokitellaan seurannan vuoksi kadonneiksi ja sensuroidaan tai suljetaan pois analyysistä.

Tutkimuspotilaat, jotka täyttävät jonkin seuraavista kriteereistä, luokitellaan peruutetuiksi: i) suostumuksen peruuttaminen; ii) hoidon epäonnistuminen; iii) vakavat haittatapahtumat, jotka edellyttävät hoidon lopettamista ennen kuin koko hoitojakso on päättynyt; iv) ilmoittautumisrikkomus; v) vapaaehtoinen protokollarikkomus; vi) tahaton protokollarikkomus

3.5.5 Laboratoriotoimenpiteet ja arviointi Mikroskooppi Seulonnassa tulee ottaa kolme objektilasia (ohut/paksut verinäytteet), joista yksi värjätään nopeasti (10 % Giemsa 10 minuutin ajan) tutkimista varten rajoitetulla määrällä kentällä P. vivaxin aseksuaalisten muotojen esiintymisen varmistamiseksi. vähintään 250/ul parasitemia. Kun potilas on otettu mukaan, kaksi muuta objektilasia värjätään huolellisemmin (3 % Giemsa 45 minuutin ajan). Tiheys ilmaistaan ​​aseksuaalisten loisten lukumääränä per µl verta ja lasketaan jakamalla aseksuaalisten loisten lukumäärä laskettujen valkosolujen määrällä ja korjattuna arvioidulla valkosolutiheydellä (tyypillisesti 8000 per µl). Kun aseksuaalisten loisten määrä on alle 10 200 valkosolua kohden, lasketaan vähintään 500 valkosolua vastaan. Veriliuska katsotaan negatiiviseksi, jos 1000 valkosolun tutkiminen ei paljasta suvuttomia loisia.

• Rengasvaiheen parasitaemia: Rengasvaiheiden lukumäärä lasketaan kaikista positiivisista diasta päivänä 0 ja uusiutumispäivänä 200 aseksuaalista loista vastaan; vain isolaatteja, joiden rengasvaiheiden osuus ylittää 65 %, käytetään ex vivo -lääkemäärityksessä.
• Gametosyytit: tiheys lasketaan laskemalla gametosyyttien määrä 500 valkosolua kohti.

Hemoglobiinitasot Hb-tasot mitataan kokoverestä, joka on kerätty mikrokyvettiin käyttämällä Hemocuea valmistajan ohjeiden mukaisesti.

CQ-konsentraation mittaus päivänä 7 ja uusiutumispäivänä 100 µl:sta verta, joka on poistettu kromatografiapaperille (31ETCHR, Whatman) Loisten molekyylien havaitseminen ja genotyypin määrittäminen DNA uutetaan ITM/NIMPE:ssä mikrotainereihin kerätyistä sormenpistoverinäytteistä. Plasmodium-lajien molekyylivahvistus päivänä 0 suoritetaan qPCR:llä, joka kohdistuu 18S ribosomaaliseen geeniin. Samaa qPCR-menetelmää käytetään P. vivax -infektioiden tunnistamiseen ja kvantifiointiin päivänä 0 ja näytteiden seurantaan.

P. vivaxin genotyypit tunnistetaan PCR-monistuksella kolmella markkerilla, jotka ovat erityisen tehokkaita sormenjälkien ottamiseen kliinisissä kokeissa (MS16, Pv3.2 ja msp1F3), mitä seuraa kapillaarigeelielektroforeesi.

RNA:n uutto ja RT-qPCR gametosyyteille RNA uutetaan RNAprotect-näytteistä ITM/NIMPE:ssä käyttäen affiniteettipylväitä ja genomisen DNA:n DNAase-digestiota. P. vivaxin gametosyyttivaiheiden havaitsemiseksi ja kvantifioimiseksi tehdään käänteistranskriptio qPCR (RT-qPCR), joka kohdistuu Pvs25-geenin transkripteihin päivällä 0 ja kaikissa seurantanäytteissä.

Lääkeresistenssilaboratorioanalyysi (päivä 0 ja uusiutuminen) Lyhyesti sanottuna veri sentrifugoidaan ja plasmaa säilytetään -20 ºC:ssa. Buffy coatin yläosa poistetaan varovasti ja säilytetään -20 ºC:ssa. Punaiset verisolut (RBC:t) suspendoidaan uudelleen PBS:ään (1:1) ja leukosyytit tyhjennetään käyttämällä selluloosapylväitä (Sigma). Suodatetut solut pestään ja pelletti mitataan ennen uudelleensuspendointia 50 % hematokriittiin McCoy-elatusaineeseen (veriväliaineseos, BMM, 4 ml).

Ex vivo -lääkeherkkyysmääritykset: Lyhyesti, levyt, joissa on valmiiksi annosteltuja 7-pisteisiä 2-kertaisia ​​CQ-, PPQ-, DHA- ja kiniinilaimennoksia, valmistetaan WWARN-menettelyjen mukaisesti [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. Pienimmät estävät pitoisuudet ja IC50 lasketaan käyttämällä in vitro -analyysi- ja raportointityökalua (IVART), jonka WWARN on kehittänyt verkossa.

G6PD-puutostesti: kaikki potilaat testataan G6PD-puutosten varalta CareStartin (Access Bio, New Jersey, USA) tekemällä hoitopistetestillä ennen PQ-hoitoa.

4. Laadunvarmistuspaikan seurantakäyntejä ajoitetaan säännöllisesti. Näiden käyntien aikana tapausraporttilomakkeille kirjatut tiedot tarkistetaan lähdeasiakirjoihin verrattuna. Kun tapausraporttilomakkeet on koottu kokeen lopussa, niiden täydellisyys ja tarkkuus tarkistetaan. Tiedot syötetään kahdesti sähköiseen tietokantaan, jossa erityisillä tietokonetarkistuksilla tunnistetaan valitut protokollarikkomukset ja tietovirheet.

Kaikki sisäänpääsyn yhteydessä olevat verifilmit luetaan tutkimuspaikalla sekä vanhempi mikroskooppi koordinointikeskuksessa. Lisäksi ITM:ssä tehdään ulkoinen laadunvalvonta 10 %:lle satunnaisesti valituista dioista. Jokaisessa molekyylimäärityksessä (qPCR, RT-qPCR ja loisten genotyypitys) 10 % NIMPE:ssä käsitellyistä näytteistä valitaan satunnaisesti analysoitaviksi uudelleen ITM:ssä. Ex vivo -lääkemäärityksen tulosten ulkoinen laadunvalvonta tehdään ITM:ssä, jossa objektilaseista tutkitaan uudelleen 10 % satunnaisesti valituista isolaateista.

5. Tilastollinen analyyttinen suunnitelma Päivän 42 paranemisasteen analyysi suoritetaan sekä hoitotarkoituksen mukaiselle (ITT) potilaspopulaatiolle että arvioitavalle potilaspopulaatiolle (protokollaa kohti). Tietojen analyysit suoritetaan STATA 12 -ohjelmistolla. Kategorisille muuttujille prosenttiosuudet ja vastaavat 95 %:n luottamusvälit lasketaan Wilsonin menetelmällä. Suhteita verrataan laskemalla *2 Yatesin korjauksella tai tarvittaessa Fisherin tarkalla testillä. Normaalisti jakautunutta jatkuvaa dataa verrataan Studentin t-testillä ja varianssianalyysillä. Tietoja, jotka eivät ole normaalijakauman mukaisia, verrataan Mann-Whitney U -testillä tai Kruskal-Wallis -varianssianalyysillä. Kahden jatkuvan muuttujan välinen korrelaatio arvioidaan käyttämällä joko Pearsonin tai Spearmanin rankkorrelaatiokerrointa tarpeen mukaan.

Hoidon epäonnistumisen kokonaisriski päivään 28 ja päivään 42 mennessä lasketaan Kaplan Meier -menetelmällä, ja riskiryhmien vertailut tehdään log rank -testillä. PCR-korjattu riski päivinä 28 ja 42 lasketaan myös kunkin toistuvan P. vivax -infektion genotyypitystulosten perusteella. Loisten poistumisaika ja -nopeus arvioidaan WWARNin kehittämän PCE-verkkotyökalun avulla (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). Keskimääräiset IC50- ja IC90-arvot CQ:lle arvioidaan käyttämällä WWARNin (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart) kehittämää In vitro -analyysi- ja raportointityökalua (IVART).

Hematologiset muutokset arvioidaan mittaamalla Hb-pitoisuuden muutokset päivien 0, 3, 7, 14, 28 ja 42 välillä.

6. Eettiset kysymykset 6.1 Eettinen hyväksyntä tutkimuksen suorittamista varten on hankittu NIMPE:n eettiseltä komitealta Hanoissa ja Antwerpenin yliopiston eettiseltä komitealta sekä Anwerpenin ITM:n instituutioiden arviointilautakunnalta.

6.2 Suostumusprosessi Potilaat otetaan mukaan tutkimukseen vain, jos he (tai lasten vanhemmat tai huoltajat) antavat tietoon perustuvan suostumuksen. Suostumuspyyntö on saatavilla englanniksi ja käännetty vietnamiksi luettavaksi kokonaan potilaalle, vanhemmalle tai huoltajalle. Yksityiskohdat kokeesta ja sen eduista ja mahdollisista riskeistä selitetään. Kun kaikkiin kysymyksiin on vastattu, asiakirjaan pyydetään allekirjoitusta. Jos potilas on lukutaidoton, lukutaitoisen todistajan on allekirjoitettava; mikäli mahdollista, osallistuja valitsee allekirjoittajan, eikä hänellä ole mitään yhteyttä tutkimusryhmään.