중부 베트남에서 Plasmodium Vivax 감염 치료를 위한 Chloroquine의 효능 평가

3.1 연구 설계 이 연구는 P.vivax 말라리아 감염 치료 후 임상 및 기생충학적 반응을 평가하기 위한 42일 약물 효능 연구로 설계되었습니다. 연구 기준을 충족하는 P. vivax 단일 감염 증상이 있는 환자가 연구에 등록되고 CQ(3일 동안 총 용량 25gm/kg)로 치료됩니다. 치료는 직접 관찰될 것이며 환자들은 확장된 WHO 프로토콜에 따라 42일 동안 적극적으로 추적 관찰될 것입니다. 추적 관찰 시간이 끝나면 모든 환자는 P.vivax 감염의 근본적인 치료를 위한 국가 지침에 따라 프리마퀸으로 치료받게 됩니다.

3.2 연구 장소 및 인구 연구는 P. falciparum 및 P.vivax 말라리아 발병률이 전국에서 가장 높은 Gia Lai 지방의 Krong Pa 지구에서 수행됩니다. 이 연구는 연구 팀이 말라리아 환자와 함께 지역 보건 직원 및 모든 주변 지역 사회와 협력할 Chu'R Cam 지역에 위치할 것입니다.

지역 인구는 주로 JaRai 소수 민족으로 구성되며 주요 직업은 삼림 지대에서 화전 농업(주로 옥수수, 마니옥 및 쌀), 고무 농장에서의 계절별 작업, 일상 용품의 소규모 생산으로 구성됩니다. 생계 또는 무역 e.g. 커피와 캐슈넛. 기후는 열대기후로 11월~4월은 건기, 5월~10월은 우기입니다. 이 지역은 언덕이 많고 숲이 우거져 있으며(2차 삼림) 주요 말라리아 매개체는 Anopheles dirus입니다.

3.4 시험 모집단 대상 모집단에는 CHC에서 자발적으로 나타나거나 지역 사회에서 능동적 스크리닝을 통해 확인된 모든 P.vivax 감염 환자(어린이 및 성인)가 포함됩니다.

3.5 시험 절차 3.5.1 선별 및 모집 선별 과정에서 기본 등록 기준을 충족하는 모든 상담 환자는 연속적인 선별 번호가 지정되고 의사가 더 심층적으로 평가합니다. 환자가 모든 등록 기준을 충족하면 환자(또는 어린이의 경우 부모 또는 보호자)에게 연구 참여에 대한 동의를 요청합니다. 그런 다음 연구 번호(ID=순차 번호 지정)가 할당됩니다. 연구에 참여하지 않기로 결정한 사람은 보건부가 정한 치료 기준에 따라 보건 시설 직원이 검사, 치료 및 후속 조치를 취하게 됩니다.

등록 시(0일) 환자를 검사하고 사전 코딩된 표준화된 설문지를 작성합니다. 등록 시 모든 환자의 정맥혈 샘플을 EDTA 또는 산-구연산-덱스트로스(EDTA/ACD)가 포함된 멸균 진공채혈관에 수집합니다. 성인의 경우 최소 5ml, 최대 8ml, 어린이의 경우 1ml/kg에서 최대 5ml의 혈액을 채취합니다. 500µL의 RNAprotect 시약(Qiagen)이 들어 있는 1.5ml 튜브에 혈액 두 방울을 넣습니다.

3.5.2 치료 모든 환자는 직접적인 감독하에 3일에 걸쳐 주어진 체중 kg당 CQ 염기 25mg(bw)의 용량으로 CQ로 완전한 치료를 받게 됩니다. 이상 반응이나 구토에 대해 치료 후 60분 동안 환자를 관찰할 것입니다. 처음 30분 이내에 약물을 토하는 환자는 전체 용량을 반복 투여받게 됩니다. 30-60분에 구토하는 사람은 절반 용량을 투여받게 됩니다. 환자가 다시 구토하면 철수하고 구조 요법을 제공합니다.

구조 약물:

경구 = 프리마퀸(14일 동안 0.25mg/kg/일)과 함께 CQ(3일, 25mg/kg); 정맥 주사(IV) = 환자가 경구 약물을 복용할 수 있을 때까지 최소 24시간 동안 Artesunate(4mg/kg/일). 그런 다음 3일 동안 경구 DHA-PPQ를 계속 사용하십시오.

근본적인 치료. primaquine 치료는 후속 조치가 끝날 때까지 연기하고 국가 지침에 따라 14일 동안 0.25mg/kg/day를 모든 G6PD 신속 검사 음성 환자에게 투여합니다.

3.5.3 0일부터 기생충 제거까지 추적 관찰 환자는 적어도 3일까지 혈액 현미경으로 12시간마다 모니터링되고 필요하다면 기생충 제거가 2개의 연속 음성 슬라이드로 정의될 때까지 더 오래 모니터링됩니다.

방문할 때마다 환자를 면담하고 검사하며 다음 결과를 위해 손가락 채혈 혈액 샘플을 채취합니다: LM 관찰을 위한 혈액 슬라이드 2개(두꺼운 필름과 얇은 필름), DNA용 EDTA/ACD 마이크로테이너 튜브에 혈액 200μl 추출하고 RNA 추출을 위해 RNAprotect가 포함된 다른 마이크로테이너 튜브에 혈액 2방울을 떨어뜨립니다. 3일째에는 추가 혈액 한 방울을 채취하여 Hemocue 방법으로 Hb 농도를 측정합니다.

7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일에 환자를 면담하고 검사하며 후속 양식을 작성하고 모든 부작용을 기록합니다. 다음 결과를 위해 손가락을 찔러 혈액 샘플을 채취합니다: LM 관찰을 위한 2개의 혈액 슬라이드(두꺼운 필름 및 얇은 필름), DNA 추출을 위한 EDTA/ACD 마이크로테이너 튜브에 혈액 200μl, 마이크로테이너 튜브를 포함하는 RNAprotect에 혈액 2방울 .

또한, 7일째에 100μl의 혈액을 여과지에 채취하여 혈중 CQ 농도를 결정합니다. 7일, 14일, 28일 및 42일에 Hb 농도(Hemocue)를 손가락을 찔러 측정합니다.

P.vivax 재발일: 재발이 확인되면 구조 치료 투여 전에 추가 정맥 혈액 샘플을 수집합니다. 이 정맥혈 100μl는 여과지에서 점적하여 혈액 CQ 농도를 결정하고 나머지는 부록 VI-C에 설명된 대로 체외 분석 및 동결 보존에 사용됩니다.

3.5.4 후속 조치 실패 프로토콜 위반 모든 합당한 노력에도 불구하고 등록된 환자가 예정된 방문에 참석하지 않고 찾을 수 없는 경우 후속 조치 실패가 발생합니다. 이 환자들에게는 치료 결과가 지정되지 않습니다. 이러한 환자는 후속 조치에 실패한 것으로 분류되고 분석에서 제외되거나 중도절단됩니다.

다음 기준 중 하나를 충족하는 연구 환자는 철회된 것으로 분류됩니다: i) 동의 철회; ii) 치료를 완료하지 못함; iii) 전체 과정이 완료되기 전에 치료를 중단해야 하는 심각한 부작용; iv) 등록 위반; v) 자발적인 프로토콜 위반; vi) 비자발적 프로토콜 위반

3.5.5 실험실 절차 및 평가 현미경 검사 3개의 슬라이드(얇은/두꺼운 혈액 도말)는 P.vivax 무성성 형태의 존재를 확인하기 위해 제한된 수의 필드에서 검사를 위해 신속하게 염색되는(10분 동안 10% Giemsa) 스크리닝 시 얻어야 합니다. 250/ul의 최소 기생충혈증에서. 환자가 등록되면 다른 두 슬라이드는 더 조심스럽게 염색됩니다(45분 동안 3% Giemsa). 밀도는 혈액 μl당 무성 기생충의 수로 표현되며 무성 기생충의 수를 계산된 WBC의 수로 나누어 계산하고 예상 WBC 밀도(일반적으로 μl당 8000개)로 보정합니다. 무성 기생충 수가 WBC 200개당 10개 미만인 경우 최소 500개 WBC에 대해 계산됩니다. 혈액 슬라이드는 1000개의 WBC 검사에서 무성 기생충이 발견되지 않으면 음성으로 간주됩니다.

• 링 단계 기생충혈증: 링 단계의 수는 200개의 무성 기생충에 대한 0일 및 재발일에 모든 양성 슬라이드에서 계산됩니다. 링 단계의 비율이 65%를 초과하는 분리물만 생체외 약물 분석에 사용됩니다.
• Gametocytes: 밀도는 WBC 500개당 gametocytes의 수를 세어 계산합니다.

헤모글로빈 수치 Hb 수치는 제조업체 지침에 따라 Hemocue를 사용하여 마이크로 큐벳에 수집된 전혈에서 측정됩니다.

크로마토그래피 종이(31ETCHR, Whatman)에 배출된 혈액 100µl에서 7일 및 재발일에 CQ 농도 측정 기생충 분자 검출 및 유전자형 분석 DNA는 마이크로테이너에서 수집된 손가락 채혈 혈액 샘플에서 ITM/NIMPE에서 추출됩니다. Day 0에서 변형체 종의 분자 확인은 18S 리보솜 유전자를 표적으로 하는 qPCR에 의해 수행될 것입니다. 동일한 qPCR 방법을 사용하여 0일 및 후속 샘플에서 P. vivax 감염을 식별하고 정량화합니다.

P. vivax 유전자형은 모세관 겔 전기영동에 이어 임상 시험에서 지문 인쇄에 특히 효과적인 3개 마커(MS16, Pv3.2 및 msp1F3)의 PCR 증폭을 통해 확인됩니다.

gametocytes에 대한 RNA 추출 및 RT-qPCR RNA는 친화도 컬럼과 게놈 DNA의 DNAse 소화를 사용하여 ITM/NIMPE의 RNAprotect 샘플에서 추출됩니다. P. vivax gametocyte 단계를 검출하고 정량화하기 위해 Pvs25 유전자 전사체를 대상으로 하는 역전사 qPCR(RT-qPCR)이 D0 및 모든 후속 샘플에서 수행됩니다.

약물 내성 실험실 분석(0일 및 재발) 간략하게, 혈액을 원심분리하고 혈장을 -20ºC에서 저장합니다. Buffy coat의 윗부분을 조심스럽게 제거하여 -20ºC에서 보관합니다. 적혈구(RBC)는 PBS(1:1)에 재현탁되고 백혈구는 셀룰로오스 컬럼(Sigma)을 사용하여 고갈됩니다. 여과된 세포는 McCoy 배지(혈액 배지 혼합물, BMM, 4ml)에서 50% 헤마토크리트에 재현탁하기 전에 세척하고 펠릿을 측정합니다.

생체 외 약물 민감도 분석: 간단히 말해, CQ, PPQ, DHA 및 퀴닌의 미리 투여된 7포인트 2배 희석액이 있는 플레이트는 WWARN 절차[http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]. 최소 억제 농도 및 IC50은 WWARN에서 온라인으로 개발한 IVART(In Vitro Analysis and Reporting Tool)를 사용하여 계산됩니다.

G6PD 결핍 검사: 모든 환자는 PQ 치료 전에 CareStart(Access Bio, New Jersey, USA)의 현장 검사를 사용하여 G6PD 결핍 검사를 받습니다.

4. 품질 보증 현장 모니터링 방문은 정기적으로 예정됩니다. 이러한 방문 중에 증례 보고서 양식에 기록된 정보는 원본 문서와 비교하여 확인됩니다. 재판이 끝날 때 사례 보고서 양식을 수집한 후 완전성과 정확성을 위해 검토합니다. 데이터는 선택된 프로토콜 위반 및 데이터 오류를 식별하기 위해 특별히 고안된 컴퓨터 검사를 사용하는 전자 데이터베이스에 이중으로 입력됩니다.

모든 혈액 도말 검사는 조정 센터의 선임 현미경 검사관뿐만 아니라 연구 현장에서도 판독됩니다. 또한 무작위로 선택한 슬라이드의 10%에 대해 ITM에서 외부 품질 관리를 수행합니다. 각 분자 분석(qPCR, RT-qPCR 및 기생충 유전자형 분석)에 대해 NIMPE에서 처리된 샘플의 10%가 무작위로 선택되어 ITM에서 재분석됩니다. 생체 외 약물 분석 결과의 외부 품질 관리는 슬라이드가 무작위로 선택된 분리물의 10%에 대해 재검사되는 ITM에서 수행됩니다.

5. 통계적 분석 계획 42일차 치료율의 분석은 ITT(intention-to-treat) 환자 모집단 및 평가 가능한 환자 모집단(프로토콜당) 모두에 대해 수행될 것입니다. 데이터 분석은 STATA 12 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 범주형 변수의 경우 백분율 및 해당 95% 신뢰 구간은 Wilson의 방법에 따라 계산됩니다. 비율은 Yates의 수정으로 *2를 계산하거나 적절한 경우 Fisher의 정확한 테스트를 통해 비교됩니다. 일반적으로 분포된 연속 데이터는 Student's t test 및 분산 분석으로 비교됩니다. 정규 분포를 따르지 않는 데이터는 Mann-Whitney U 검정 또는 Kruskal-Wallis 분산 분석으로 비교됩니다. 2개의 연속 변수 간의 상관관계는 필요에 따라 Pearson 또는 Spearman의 순위 상관 계수를 사용하여 평가됩니다.

28일 및 42일까지의 전체 치료 실패 위험은 Kaplan Meier 방법으로 계산하고 위험 그룹 간의 비교는 로그 순위 테스트를 사용하여 수행합니다. 28일과 42일의 PCR 조정 위험도 각 재발성 P.vivax 감염의 유전형 분석 결과에 따라 계산됩니다. 기생충 제거 시간 및 속도는 WWARN(http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator)에서 개발한 PCE 온라인 도구를 사용하여 추정됩니다. CQ에 대한 평균 IC50 및 IC90은 WWARN(http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart)에서 개발한 체외 분석 및 보고 도구(IVART)를 사용하여 추정됩니다.

혈액학적 변화는 각각 0일, 3일, 7일, 14일, 28일 및 42일 사이에 Hb 농도의 변화를 측정함으로써 평가될 것이다.

6. 윤리적 문제 6.1 연구를 수행하기 위한 윤리적 승인은 하노이 NIMPE 윤리위원회와 앤트워프 대학 윤리위원회 및 앤워프 ITM의 기관 검토 위원회에서 획득했습니다.

6.2 동의 과정 환자(또는 아동의 부모 또는 보호자)가 정보에 입각한 동의를 한 경우에만 환자가 연구에 포함됩니다. 동의 요청은 영어로 제공되며 베트남어로 번역되어 환자, 부모 또는 보호자가 모두 읽을 수 있습니다. 시험과 그 이점 및 잠재적 위험에 대한 세부 사항이 설명됩니다. 질문에 대한 답변이 완료되면 문서에 서명이 요청됩니다. 환자가 글을 읽을 수 없는 경우 글을 읽을 수 있는 증인이 서명해야 합니다. 가능한 경우 서명인은 참가자가 선택하며 연구팀과 연결되지 않습니다.