Valutazione dell'efficacia della clorochina per il trattamento delle infezioni da Plasmodium Vivax nel Vietnam centrale

3.1 Disegno dello studio Questo studio è concepito come uno studio sull'efficacia del farmaco della durata di 42 giorni per valutare le risposte cliniche e parassitologiche dopo il trattamento delle infezioni da malaria da P.vivax. I pazienti sintomatici con mono-infezioni da P. vivax, che soddisfano i criteri dello studio, verranno arruolati nello studio e trattati con CQ (dose totale 25 g/kg per 3 giorni). Il trattamento sarà osservato direttamente e i pazienti saranno seguiti attivamente per 42 giorni secondo un protocollo esteso dell'OMS. Al termine del periodo di follow-up, tutti i pazienti saranno trattati con primachina seguendo le linee guida nazionali per la cura radicale delle infezioni da P.vivax.

3.2 Sito di studio e popolazione Lo studio sarà condotto nel distretto di Krong Pa, provincia di Gia Lai, dove l'incidenza della malaria sia da P.falciparum che da P.vivax è tra le più alte del paese. Lo studio sarà situato nel comune di Chu'R Cam, dove il team dello studio lavorerà con il personale sanitario locale e tutti i comuni circostanti con malati di malaria.

La popolazione locale è composta principalmente dalla minoranza etnica JaRai e l'occupazione principale consiste nell'agricoltura taglia e brucia (principalmente mais, manioca e riso) nei campi forestali, insieme al lavoro stagionale nelle piantagioni di gomma e alla produzione su piccola scala di beni per la vita quotidiana. sussistenza o commercio, ad es. caffè e anacardi. Il clima è tropicale con la stagione secca da novembre ad aprile e la stagione delle piogge da maggio a ottobre. L'area è collinare e boscosa (foresta secondaria) e il principale vettore della malaria è Anopheles dirus.

3.4 Popolazione dello studio La popolazione target include tutti i pazienti infetti da P.vivax (bambini e adulti) che si presentano spontaneamente al CHC o identificati attraverso lo screening attivo nella comunità.

3.5 Procedure di sperimentazione 3.5.1 Screening e reclutamento A tutti i pazienti consultati che soddisfano i criteri di arruolamento di base durante lo screening verrà assegnato un numero progressivo di screening e valutati in modo più approfondito dal medico. Una volta che il paziente soddisfa tutti i criteri di iscrizione, a lui o lei (o un genitore o tutore in caso di bambini) verrà chiesto il consenso a partecipare allo studio. Quindi, gli verrà assegnato un numero di studio (ID = numerazione sequenziale). Qualsiasi persona che decide di non partecipare allo studio sarà esaminata, curata e seguita dal personale della struttura sanitaria secondo lo standard di cura stabilito dal Ministero della Salute.

Al momento dell'arruolamento (Giorno 0) il paziente verrà esaminato e verrà compilato un questionario precodificato standardizzato. Un campione di sangue venoso verrà raccolto in provette vacutainer sterili contenenti EDTA o acido-citrato-destrosio (EDTA/ACD) da tutti i pazienti al momento dell'arruolamento. Verranno raccolti un minimo di 5 ml di sangue - e un massimo di 8 ml - da adulti e da 1 ml/kg fino a 5 ml da bambini. Due gocce di sangue verranno aggiunte in una provetta da 1,5 ml contenente 500 µL di reagente RNAprotect (Qiagen).

3.5.2 Trattamento Tutti i pazienti riceveranno un trattamento completo con CQ alla dose di 25 mg di CQ base per kg di peso corporeo (pc) somministrato nell'arco di 3 giorni e sotto diretta supervisione. I pazienti saranno osservati per 60 minuti dopo il trattamento per reazioni avverse o vomito. Quei pazienti che vomitano il farmaco entro i primi 30 minuti riceveranno una dose completa ripetuta; quelli che vomitano da 30-60 minuti riceveranno metà dose. Se il paziente vomita di nuovo, verrà ritirato e gli verrà offerta una terapia di salvataggio.

Farmaci di salvataggio:

Orale=CQ (3 giorni, 25 mg/kg) insieme a primachina (0,25 mg/kg/giorno per 14 giorni); Endovenoso (IV)= Artesunato (4 mg/kg/giorno) per un minimo di 24 ore e fino a quando il paziente non è in grado di assumere farmaci per via orale. Quindi continuare con DHA-PPQ orale per 3 giorni.

Cura radicale. il trattamento con primachina sarà ritardato fino alla fine del follow-up e somministrato come raccomandato dalle linee guida nazionali, ovvero 0,25 mg/kg/giorno per 14 giorni a tutti i pazienti con test rapido G6PD negativo.

3.5.3 Follow-up Dal giorno 0 fino alla clearance del parassita i pazienti saranno monitorati ogni 12 ore mediante microscopia del sangue almeno fino al giorno 3 e più a lungo se necessario fino alla clearance del parassita definita come due vetrini negativi consecutivi.

Ad ogni visita, il paziente verrà intervistato ed esaminato e verrà prelevato un campione di sangue con puntura del dito per i seguenti risultati: due vetrini di sangue per l'osservazione LM (film spesso e sottile), 200 μl di sangue in una provetta microtainer EDTA/ACD per il DNA estrazione e 2 gocce di sangue in un'altra provetta microtainer contenente RNAprotect per l'estrazione dell'RNA. Al giorno 3, verrà prelevata un'ulteriore goccia di sangue per misurare la concentrazione di Hb con il metodo Hemocue.

Giorno 7, 14, 21, 28, 35, 42 I pazienti saranno intervistati ed esaminati, il modulo di follow-up sarà completato e qualsiasi evento avverso documentato. Verrà raccolto un campione di sangue con puntura del dito per i seguenti risultati: due vetrini di sangue per l'osservazione LM (film spesso e sottile), 200 μl di sangue in una provetta microtainer EDTA / ACD per l'estrazione del DNA e 2 gocce di sangue in provetta contenente microtainer RNAprotect .

Inoltre, al giorno 7, verranno prelevati 100 μl di sangue su carta da filtro per determinare la concentrazione di CQ nel sangue. Ai giorni 7, 14, 28 e 42 la concentrazione di Hb (Hemocue) sarà misurata dalla puntura del dito.

Giorno della recidiva di P.vivax: se la recidiva è confermata, verrà raccolto un ulteriore campione di sangue venoso prima della somministrazione del trattamento di soccorso. 100 μl di questo sangue venoso saranno individuati su carta da filtro per determinare la concentrazione di CQ nel sangue, il restante sarà utilizzato per l'analisi ex vivo e la crioconservazione come dettagliato nell'allegato VI-C.

3.5.4 Perdita per violazioni del protocollo di follow-up La perdita per follow-up si verifica quando, nonostante tutti gli sforzi ragionevoli, un paziente arruolato non si presenta alle visite programmate e non può essere trovato. Nessun esito del trattamento sarà assegnato a questi pazienti. Questi pazienti saranno classificati come persi al follow-up e censurati o esclusi dall'analisi.

I pazienti dello studio che soddisfano uno dei seguenti criteri saranno classificati come ritirati: i) ritiro del consenso; ii) mancato completamento del trattamento; iii) eventi avversi gravi che richiedono l'interruzione del trattamento prima del completamento dell'intero ciclo; iv) violazione dell'iscrizione; v) violazione volontaria del protocollo; vi) violazione involontaria del protocollo

3.5.5 Procedure di laboratorio e valutazione Microscopia Allo screening devono essere ottenuti tre vetrini (strisci di sangue sottili/spessi), uno colorato rapidamente (Giemsa al 10% per 10 min) per l'esame in un numero limitato di campi per garantire la presenza di forme asessuate di P.vivax ad una parassitemia minima di 250/ul. Una volta arruolato il paziente, gli altri due vetrini verranno colorati con maggiore attenzione (3% Giemsa per 45 min). La densità, sarà espressa come numero di parassiti asessuati per µl di sangue, e calcolata dividendo il numero di parassiti asessuali per il numero di globuli bianchi contati e corretti per la densità stimata dei globuli bianchi (tipicamente 8000 per µl). Quando il conteggio del parassita asessuato è inferiore a 10 per 200 globuli bianchi, il conteggio verrà eseguito su almeno 500 globuli bianchi. Un vetrino di sangue sarà considerato negativo quando l'esame di 1000 globuli bianchi non rivelerà parassiti asessuati.

• Parassitemia ad anello: il numero di stadi ad anello verrà conteggiato in tutti i vetrini positivi al giorno 0 e al giorno della recidiva contro 200 parassiti asessuati; solo gli isolati per i quali la proporzione di stadi ad anello supera il 65% saranno utilizzati per l'analisi farmacologica ex vivo.
• Gametociti: la densità sarà calcolata contando il numero di gametociti per 500 GB.

Livelli di emoglobina I livelli di emoglobina saranno misurati su sangue intero raccolto in microcuvetta usando Hemocue seguendo le istruzioni del produttore.

Misurazione della concentrazione di CQ al giorno 7 e al giorno della recidiva da 100 µl di sangue espulso su carta cromatografica (31ETCHR, Whatman) Il rilevamento molecolare del parassita e la genotipizzazione del DNA saranno estratti all'ITM/NIMPE da campioni di sangue prelevati dal dito raccolti in microtainer. La conferma molecolare delle specie di Plasmodium al giorno 0 sarà eseguita mediante qPCR mirata al gene ribosomiale 18S. Lo stesso metodo qPCR verrà utilizzato per identificare e quantificare le infezioni da P. vivax al giorno 0 e campioni di follow-up.

I genotipi di P. vivax saranno identificati attraverso l'amplificazione PCR di 3 marcatori particolarmente efficaci per il finger-printing negli studi clinici (MS16, Pv3.2 e msp1F3) seguita da elettroforesi su gel capillare.

Estrazione dell'RNA e RT-qPCR per i gametociti L'RNA sarà estratto dai campioni di RNAprotect all'ITM/NIMPE utilizzando colonne di affinità e digestione con DNAsi del DNA genomico. Per rilevare e quantificare gli stadi dei gametociti di P. vivax sarà eseguita una qPCR di trascrizione inversa (RT-qPCR) mirata ai trascritti del gene Pvs25 su D0 e in tutti i campioni di follow-up.

Analisi di laboratorio di resistenza ai farmaci (Giorno 0 e di recidiva) In breve, il sangue sarà centrifugato e il plasma sarà conservato a -20ºC. La parte superiore del buffy coat verrà rimossa con cura e conservata a -20ºC. I globuli rossi (RBC) saranno risospesi in PBS (1:1) ei leucociti saranno depletati utilizzando colonne di cellulosa (Sigma). Le cellule filtrate saranno lavate e il pellet misurato prima della risospensione al 50% di ematocrito in terreno McCoy (miscela di terreno sanguigno, BMM, 4 ml).

Saggi di sensibilità ai farmaci ex vivo: in breve, le piastre con diluizioni predosate di 7 punti 2 volte di CQ, PPQ, DHA e chinino saranno preparate seguendo le procedure WWARN [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .PDF]. Le concentrazioni inibitorie minime e l'IC50 saranno calcolate utilizzando l'In Vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) sviluppato online dal WWARN.

Test del deficit di G6PD: tutti i pazienti saranno testati per il deficit di G6PD utilizzando il test point-of-care di CareStart (Access Bio, New Jersey, USA) prima del trattamento PQ.

4. Le visite di monitoraggio del sito di garanzia della qualità saranno programmate su base regolare. Durante queste visite, le informazioni registrate sui moduli di segnalazione dei casi saranno verificate rispetto ai documenti di origine. Dopo che i moduli di segnalazione del caso sono stati raccolti alla fine del processo, saranno esaminati per completezza e accuratezza. I dati verranno inseriti due volte in un database elettronico, dove vengono utilizzati controlli informatici appositamente progettati per identificare le violazioni del protocollo selezionate e gli errori dei dati.

Tutti gli strisci di sangue al momento del ricovero verranno letti presso il sito dello studio e da un microscopista senior presso un centro di coordinamento. Inoltre, presso l'ITM verrà effettuato un controllo di qualità esterno sul 10% dei vetrini selezionati casualmente. Per ciascuno dei saggi molecolari (qPCR, RT-qPCR e genotipizzazione del parassita) il 10% dei campioni processati al NIMPE sarà scelto casualmente per essere analizzato nuovamente all'ITM. Il controllo di qualità esterno dei risultati del test farmacologico ex vivo verrà eseguito presso l'ITM, dove i vetrini verranno riesaminati per il 10% degli isolati scelti a caso.

5. Piano analitico statistico L'analisi del tasso di guarigione al giorno 42 verrà eseguita sia per la popolazione di pazienti per intenzione di trattare (ITT) che per la popolazione di pazienti valutabili (per protocollo). Le analisi dei dati saranno eseguite utilizzando il software STATA 12. Per le variabili categoriali le percentuali ei corrispondenti intervalli di confidenza al 95% saranno calcolati secondo il metodo di Wilson. Le proporzioni saranno confrontate calcolando il *2 con la correzione di Yates o con il test esatto di Fisher ove appropriato. I dati continui normalmente distribuiti saranno confrontati con il test t di Student e l'analisi della varianza. I dati non conformi a una distribuzione normale saranno confrontati con il test U di Mann-Whitney o con l'analisi della varianza di Kruskal-Wallis. La correlazione tra 2 variabili continue sarà valutata utilizzando il coefficiente di correlazione per ranghi di Pearson o Spearman come richiesto.

Il rischio complessivo di fallimento del trattamento entro il giorno 28 e entro il giorno 42 sarà calcolato con il metodo Kaplan Meier e i confronti tra i gruppi di rischio saranno effettuati utilizzando il log rank test. Il rischio aggiustato per PCR al giorno 28 e 42 sarà calcolato anche in seguito ai risultati della genotipizzazione di ciascuna infezione ricorrente da P.vivax. Il tempo e il tasso di eliminazione del parassita saranno stimati utilizzando lo strumento online PCE sviluppato da WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator). La media IC50 e IC90 per CQ sarà stimata utilizzando lo strumento di analisi e reporting in vitro (IVART) sviluppato da WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart).

I cambiamenti ematologici saranno valutati misurando i cambiamenti nella concentrazione di Hb tra i giorni 0, 3, 7, 14, 28 e 42, rispettivamente.

6. Questioni etiche 6.1 L'autorizzazione etica per condurre lo studio sarà stata ottenuta dal Comitato etico del NIMPE, Hanoi e dal Comitato etico dell'Università di Anversa, nonché dall'Institutional Review Board dell'ITM, Anversa.

6.2 Processo di consenso I pazienti saranno inclusi nello studio solo se essi (o i genitori oi tutori dei bambini) danno il consenso informato. La richiesta di consenso è disponibile in inglese e tradotta in vietnamita per essere letta interamente al paziente, genitore o tutore. Saranno spiegati i dettagli sulla sperimentazione e sui suoi benefici e potenziali rischi. Dopo aver risposto a tutte le domande, verrà richiesta una firma sul documento. Se il paziente è analfabeta, deve firmare un testimone istruito; se possibile, il firmatario sarà selezionato dal partecipante e non avrà alcun legame con il gruppo di ricerca.