ベトナム中部における三日熱マラリア原虫感染症の治療に対するクロロキンの有効性の評価

3.1 研究デザイン この研究は、P.vivax マラリア感染の治療後の臨床的および寄生虫学的反応を評価するための 42 日間の薬効研究として設計されています。 研究基準を満たす三日熱マラリア原虫単一感染症の症候性患者を研究に登録し、CQ (3 日間で総用量 25 gm/kg) で治療します。 治療は直接観察され、患者は拡張されたWHOプロトコルに従って42日間積極的にフォローアップされます。 フォローアップ時間の終わりに、すべての患者は、P.vivax感染症の根治のための国のガイドラインに従って、プリマキンで治療されます。

3.2 研究場所と人口 研究は、熱帯熱マラリア原虫と三日熱マラリア原虫の両方の発生率が国内で最も高いザライ省のクロンパ地区で実施されます。 この研究は、研究チームが地元の医療スタッフおよびマラリア患者がいる周辺のすべてのコミューンと協力するChu'R Camコミューンで行われます。

地元の人口は主にジャライ族の少数民族で構成されており、主な職業は森林地帯での焼畑農業（主にトウモロコシ、キャッサバ、米）、ゴム農園での季節労働、日用品の小規模生産です。自給自足または貿易。 コーヒーとカシューナッツ。 気候は熱帯性気候で、11 月から 4 月までが乾季、5 月から 10 月までが雨季です。 この地域は丘陵地帯で森林に覆われており（二次林）、主なマラリア媒介生物はハマダラカです。

3.4 試験集団 対象集団には、CHC で自然発生したか、コミュニティでの積極的なスクリーニングを通じて特定された、すべての P.vivax 感染患者 (小児および成人) が含まれます。

3.5 試験手順 3.5.1 スクリーニングと募集 スクリーニング中に基本的な登録基準を満たすすべての受診患者には、連続したスクリーニング番号が割り当てられ、医師によってより詳細に評価されます。 患者がすべての登録基準を満たした時点で、患者 (子供の場合は親または保護者) に研究への参加の同意を求めます。 その後、研究番号（ID=連番）が割り当てられます。 研究に参加しないことを決定した人は、保健省によって確立されたケアの基準に従って、医療施設のスタッフによって検査、治療、およびフォローアップされます。

登録時（0日目）に、患者は検査され、標準化された事前コード化されたアンケートに記入されます。 静脈血サンプルは、登録時にすべての患者から EDTA またはクエン酸デキストロース (EDTA/ACD) を含む滅菌バキュテナー チューブに収集されます。 成人からは最低 5ml、最大 8ml の血液が採取され、子供からは 1ml/kg で最大 5ml が採取されます。 500 μL の RNAprotect 試薬 (Qiagen) を含む 1.5 ml チューブに 2 滴の血液を加えます。

3.5.2 治療 すべての患者は、3日間にわたって直接監督下で、体重1kgあたり25mgのCQベースの用量でCQによる完全な治療を受けます。 副作用や嘔吐の治療後、患者は 60 分間観察されます。 最初の 30 分以内に薬を嘔吐した患者は、全量を繰り返し服用します。 30 ～ 60 分間嘔吐した場合は、半量になります。 患者が再び嘔吐した場合、患者は治療を中止し、救助療法を提供します。

レスキュー薬:

経口 = CQ (3 日間、25mg/kg) とプリマキン (0.25mg/kg/日を 14 日間)。静脈内 (IV) = Artesunate (4mg/kg/日) を最低 24 時間、患者が経口薬を服用できるようになるまで。 その後、経口 DHA-PPQ を 3 日間続けます。

根本治療。 プリマキン治療はフォローアップの終わりまで延期され、国のガイドラインで推奨されているように、つまり、G6PD迅速検査が陰性のすべての患者に0.25mg / kg /日を14日間投与します。

3.5.3 フォローアップ 0日目から寄生虫除去まで 患者は、少なくとも3日目まで、必要に応じて2つの連続した陰性スライドとして定義される寄生虫除去まで、血液顕微鏡によって12時間ごとに監視されます。

各訪問で、患者はインタビューを受けて検査され、次の結果のために指刺し血液サンプルが収集されます。抽出、および RNA 抽出用の RNAprotect を含む別の microtainer チューブに 2 滴の血液。 3日目に、ヘモキュー法でHb濃度を測定するために、さらに1滴の血液を採取します。

7日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日目 患者はインタビューを受けて検査され、フォローアップフォームに記入され、有害事象が記録されます。 指刺し血液サンプルは、次の結果のために収集されます: LM 観察用の 2 つの血液スライド (厚膜および薄膜)、DNA 抽出用の EDTA/ACD マイクロテイナー チューブ内の 200 μl の血液、およびマイクロテイナー チューブを含む RNAprotect 内の 2 滴の血液.

さらに、7日目に、100μlの血液をろ紙に採取して、血中CQ濃度を決定します。 ７日目、１４日目、２８日目、および４２日目に、Ｈｂ濃度（Ｈｅｍｏｃｕｅ）を指刺しから測定する。

三日熱マラリアの再発日: 再発が確認された場合は、レスキュー治療の投与前にさらに静脈血サンプルが採取されます。 この静脈血 100μl をろ紙にスポットして血中 CQ 濃度を測定し、残りは付属書 VI-C に詳述されているように ex vivo アッセイと凍結保存に使用します。

3.5.4 フォローアッププロトコル違反の喪失 フォローアップの喪失は、あらゆる合理的な努力にもかかわらず、登録された患者が予定された来院に出席せず、見つからない場合に発生します。 これらの患者に割り当てられる治療結果はありません。 これらの患者は、追跡不能として分類され、分析から除外または除外されます。

以下の基準のいずれかを満たす研究患者は、撤回されたと分類されます。 i) 同意の撤回。 ii) 治療を完了できなかった; iii) 全コースが完了する前に治療を終了する必要がある重篤な有害事象; iv) 登録違反。 v) 自発的なプロトコル違反。 vi) 非自発的プロトコル違反

3.5.5 検査手順と評価 顕微鏡検査 スクリーニング時に 3 枚のスライド (薄い/濃い血液塗抹標本) を取得する必要があります。そのうちの 1 枚は迅速に染色 (10% ギムザで 10 分間) し、限定された数の視野で検査して P.vivax 無性形態の存在を確認します。 250 / ulの最小寄生虫血症で。 患者が登録されると、他の 2 つのスライドがより慎重に染色されます (3% ギムザで 45 分間)。 密度は、血液 1 μl あたりの無性寄生虫の数として表され、無性寄生虫の数を数えられた白血球の数で割って計算され、推定された白血球密度 (通常、1 μl あたり 8000) によって補正されます。 無性寄生虫数が 200 WBCs あたり 10 未満の場合、カウントは少なくとも 500 WBCs に対して行われます。 1000個の白血球の検査で無性寄生虫が見つからない場合、血液スライドは陰性と見なされます。

• リング ステージ寄生虫: リング ステージの数は、200 の無性寄生虫に対する 0 日目と再発日のすべての肯定的なスライドでカウントされます。リング段階の割合が 65% を超える分離株のみが、ex vivo 薬物アッセイに使用されます。
• 配偶子母細胞: 密度は、500 WBCs あたりの配偶子母細胞の数を数えることによって計算されます。

ヘモグロビン レベル Hb レベルは、製造元の指示に従って Hemocue を使用して、マイクロ キュベットに収集された全血で測定されます。

クロマト紙（31ETCHR、Whatman）に排出された 100 μl の血液からの 7 日目および再発日の CQ 濃度の測定 0日目のマラリア原虫種の分子確認は、18Sリボソーム遺伝子をターゲットとするqPCRによって行われます。 同じ qPCR メソッドを使用して、0 日目の P. vivax 感染を特定および定量化し、サンプルを追跡します。

三日熱マラリア原虫の遺伝子型は、臨床試験でのフィンガープリンティングに特に有効な 3 つのマーカー (MS16、Pv3.2、および msp1F3) の PCR 増幅と、それに続くキャピラリーゲル電気泳動によって識別されます。

配偶子母細胞の RNA 抽出と RT-qPCR RNA は、アフィニティーカラムとゲノム DNA の DNAse 消化を使用して、ITM/NIMPE で RNAprotect サンプルから抽出されます。 P. vivax 配偶子母細胞の段階を検出および定量化するために、Pvs25 遺伝子転写産物をターゲットとする逆転写 qPCR (RT-qPCR) が D0 およびすべてのフォローアップ サンプルで行われます。

薬剤耐性検査室分析 (0 日目および再発時) 手短に言えば、血液を遠心分離し、血漿を -20ºC で保存します。 バフィーコートの上部を慎重に取り除き、-20℃で保存します。 赤血球（ＲＢＣ）をＰＢＳ（１：１）に再懸濁し、セルロースカラム（Ｓｉｇｍａ）を使用して白血球を枯渇させる。 ろ過した細胞を洗浄し、ペレットを測定してから、マッコイ培地（血液培地混合物、BMM、4ml）に50％ヘマトクリットで再懸濁します。

Ex vivo 薬物感受性アッセイ: 簡単に説明すると、WWARN 手順 [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity] に従って、CQ、PPQ、DHA、およびキニーネの 7 ポイント 2 倍希釈液を事前に投与したプレートを調製します。 .pdf]。 最小阻害濃度と IC50 は、WWARN によってオンラインで開発された In Vitro Analysis and Reporting Tool (IVART) を使用して計算されます。

G6PD欠乏検査：すべての患者は、CareStart（アクセスバイオ、ニュージャージー、米国）によるポイントオブケアテストを使用して、PQ治療の前にG6PD欠乏症について検査されます。

4. 品質保証 サイトの監視訪問が定期的にスケジュールされます。 これらの訪問中に、症例報告フォームに記録された情報がソース ドキュメントに対して検証されます。 治験終了時に症例報告書が照合された後、それらの完全性と正確性が審査されます。 データは電子データベースに二重に入力され、特別に設計されたコンピューター チェックを使用して、選択されたプロトコル違反とデータ エラーが特定されます。

入院時のすべての血液フィルムは、研究サイトで、また調整センターの上級顕微鏡士によって読み取られます。 さらに、ランダムに選択されたスライドの 10% に対して ITM で外部品質管理が行われます。 分子アッセイ (qPCR、RT-qPCR、寄生虫ジェノタイピング) のそれぞれについて、NIMPE で処理されたサンプルの 10% がランダムに選択され、ITM で再分析されます。 ex vivo 薬物アッセイ結果の外部品質管理は ITM で行われ、ランダムに選択された分離株の 10% についてスライドが再検査されます。

5. 統計分析計画 42 日目の治癒率の分析は、治療意図 (ITT) 患者集団と評価可能な患者集団 (プロトコルごと) の両方に対して実行されます。 データ分析は、STATA 12 ソフトウェアを使用して実行されます。 カテゴリ変数のパーセンテージと対応する 95% 信頼区間は、ウィルソンの方法に従って計算されます。 割合は、必要に応じてイェーツの補正またはフィッシャーの正確確率検定で *2 を計算することによって比較されます。 正規分布の連続データは、スチューデントの t 検定と分散分析によって比較されます。 正規分布に従わないデータは、Mann-Whitney U 検定または Kruskal-Wallis 分散分析によって比較されます。 2 つの連続変数間の相関は、ピアソンまたはスピアマンの順位相関係数を必要に応じて使用して評価されます。

28日目および42日目までの治療失敗の全体的なリスクは、カプランマイヤー法によって計算され、ログランク検定を使用してリスクグループ間の比較が行われます。 28 日目と 42 日目の PCR 調整リスクも、各再発 P.vivax 感染のジェノタイピング結果に従って計算されます。 WWRN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator) によって開発された PCE オンライン ツールを使用して、寄生虫クリアランスの時間と率を推定します。 CQ の平均 IC50 および IC90 は、WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart) によって開発された In vitro 分析および報告ツール (IVART) を使用して推定されます。

血液学的変化は、それぞれ０、３、７、１４、２８および４２日の間のＨｂ濃度の変化を測定することによって評価される。

6. 倫理的問題 6.1 研究を実施するための倫理的認可は、ハノイの NIMPE の倫理委員会およびアントワープ大学の倫理委員会、ならびに ITM の機関審査委員会から得られます。

6.2 同意プロセス 患者 (または子供の親または保護者) がインフォームド コンセントを与える場合にのみ、患者は研究に含まれます。 同意要求は英語で入手でき、ベトナム語に翻訳され、患者、親、または保護者に完全に読まれます。 試験の詳細とその利点と潜在的なリスクについて説明します。 質問に回答すると、書類に署名が求められます。 患者が読み書きができない場合は、読み書きができる証人が署名する必要があります。可能であれば、署名者は参加者によって選択され、研究チームとは関係ありません。