类风湿性关节炎中的 NFKB1 和 IKK Epsilon (NUIRA)

根据疾病活动评分 28 (DAS28) 将确诊为 RA 的患者分为两组：a) 有临床活动和 b) 有临床缓解。 关键的排除标准是患有任何其他炎症或自身免疫性疾病的患者以及感染的患者。 对照组由健康患者代表 样本大小

样本量计算通过以下公式进行：

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq N=30，Z=2.46（99% 的置信度），p=0.9，q=0.1，d=0.05（95% 的准确度）。 样本量包含 20 名 RA 患者。

人体测量值重量 (kg) 和高度 (m) 在机械柱秤 (SECA) 中计算。 患者根据体重指数（BMI，体重 (Kg)/身高 (m)2）分为 a) 正常体重 (BMI< 24.9)，b) 超重 (24.9 kg/m2 < BMI<29.9 kg/m2) 和 c) 肥胖 (BMI> 30 kg/m2)。

淋巴细胞提取 使用 ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY) 试剂盒从外周血中提取淋巴细胞。 简言之，将 EDTA 管（BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ）中的静脉血样以 3500 rpm 离心 5-8 分钟。 提取所得中间白色相并置于eppendorf管中；加入 1 mL ACK Lysing Buffer® 并小心重悬。 再一次，将悬浮液以 3500 rpm 离心 5-8 分钟，弃去上清液。 重复这最后一步，直到白细胞包完全变白。 最后，加入 100 mcl 的 ACK Lysing Buffer® 并冷冻于 -70ºC 以备后用。

基因表达 使用 Magna Pure LC RNA 分离试剂盒 III（Roche）在 Magna Pure LC 2.0 仪器中从白细胞包（约 10 至 15 mg）中提取信使 RNA (mRNA)。 A260/A280 nm 吸光度比 > 1.8（质量），总 RNA 浓度是通过使用 NanoPhotometer（Implen GmbH，德国）确定 260 nm 处的吸光度来计算的，并将提取物调整为 20 µg DNA 的浓度，用于PCR反应。

随后，用 Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science) 合成 cDNA。 使用 NF-KB1、IKK epsilon 和 18s（作为组成基因）的特异性引物和探针，使用 7500 快速实时 PCR 系统（Applied Biosystems，Applera UK，Cheshire）进行实时聚合酶链反应（qPCR） , UK)，混合 TaqMan® Universal PCR Master Mix 和每个基因的特异性探针 NF-KB1 (Hs00765730-m1)、IKK epsilon (Hs01063858-m1) 和 18S (Hs99999901-s1)，（Applied Biosystems，Applera UK，Cheshire ， 英国）。

根据从两个不同组获得的Ct，通过Pfaffl相对定量方法计算相对表达单位，其中以健康患者作为对照。

统计分析 统计分析是通过 Sigmaplot 软件版本 12.0 进行的。 参数和非参数测试用于变量分布的函数：在用于比较组的参数测试中，包括学生的 T 测试；应用的非参数检验是：Mann-Whitney U 检验和 Shapiro-Wilk 检验。 最后，使用 SPSS 软件 22.0 版的接受者操作特征 (ROC) 分析 NF-KB1/IKK epsilon 的基因表达。