NFKB1 en IKK Epsilon bij reumatoïde artritis (NUIRA)

Patiënten met een bevestigde diagnose van RA werden ingedeeld in twee groepen op basis van de Disease Activity Score 28 (DAS28): a) met klinische activiteit en b) met klinische remissie. De belangrijkste uitsluitingscriteria waren patiënten met een andere inflammatoire of auto-immuunziekte en patiënten met infecties. De controlegroep werd vertegenwoordigd door gezonde patiënten Steekproefomvang

De berekening van de steekproefomvang is uitgevoerd met de volgende formule:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Met N=30, Z=2,46 (99% betrouwbaarheid), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% nauwkeurigheid). De steekproefomvang bevatte 20 patiënten met RA.

Antropometrische metingen Gewicht (kg) en lengte (m) werden berekend in een mechanische kolomweegschaal (SECA). De patiënten werden geclassificeerd volgens hun Body mass index (BMI, gewicht (Kg)/lengte (m)2) als a) normaal gewicht (BMI< 24,9), b) overgewicht (24,9 kg/m2 <BMI<29,9 kg/m2) en c) obesitas (BMI > 30 kg/m2).

Lymfocytextractie Lymfocyten uit perifeer bloed werden geëxtraheerd met behulp van de ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY) kit. In het kort werd een veneus bloedmonster in een EDTA-buis (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ) gecentrifugeerd bij 3500 rpm gedurende 5-8 minuten. De resulterende witgekleurde tussenfase werd geëxtraheerd en in een eppendorfbuis geplaatst; 1 ml ACK Lysing Buffer® werd toegevoegd en voorzichtig opnieuw gesuspendeerd. Opnieuw werd de suspensie gecentrifugeerd bij 3500 rpm gedurende 5-8 minuten en het supernatant werd weggegooid. Deze laatste stap werd herhaald totdat het leukocytenpakket helemaal wit was. Ten slotte werd er 100 mcl ACK Lysing Buffer® aan toegevoegd en ingevroren bij -70ºC voor later gebruik.

Genetische expressie Van het leukocytenpakket (ongeveer 10 tot 15 mg) werd een messenger RNA (mRNA)-extractie uitgevoerd met behulp van de Magna Pure LC RNA-isolatiekit III (Roche) in het Magna Pure LC 2.0-instrument. De A260/A280 nm-absorptieverhouding was> 1,8 (kwaliteit) en de totale RNA-concentratie werd berekend door de absorptie bij 260 nm te bepalen, vastgesteld met de NanoPhotometer (Implen GmbH, Duitsland) en de extracten werden aangepast tot een concentratie van 20 µg DNA voor de PCR-reactie.

Vervolgens werd het cDNA gesynthetiseerd met de Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). Er werd een real-time polymerasekettingreactie (qPCR) uitgevoerd, met behulp van de specifieke primers en probes voor NF-KB1, IKK epsilon en 18s (als constitutief gen), met behulp van een 7500 Fast Real Time PCR-systeem (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , UK), het mengen van TaqMan® Universal PCR Master Mix en de specifieke probes voor elk gen NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) en 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , VK).

Volgens de Ct verkregen uit de twee verschillende groepen werden de relatieve uitdrukkingseenheden berekend door middel van de relatieve kwantificeringsmethode van Pfaffl, waarin het werd gebruikt als controle van een gezonde patiënt.

Statistische analyse De statistische analyse werd uitgevoerd door middel van de Sigmaplot software versie 12.0. Parametrische en niet-parametrische tests werden gebruikt in functie van de variabelenverdeling: onder de parametrische tests die werden uitgevoerd om de groepen te vergelijken, werd de Student's T-test opgenomen; de toegepaste niet-parametrische tests waren: de Mann-Whitney U-test en de Shapiro-Wilk-test. Ten slotte werd een receiver operating Characteristic (ROC) gebruikt voor de analyse van de genetische expressie van NF-KB1/IKK epsilon met de SPSS-softwareversie 22.0.