NFKB1 und IKK Epsilon bei rheumatoider Arthritis (NUIRA)

Patienten mit einer bestätigten RA-Diagnose wurden basierend auf dem Disease Activity Score 28 (DAS28) in zwei Gruppen eingeteilt: a) mit klinischer Aktivität und b) mit klinischer Remission. Wichtige Ausschlusskriterien waren Patienten mit anderen entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen und Patienten mit Infektionen. Die Kontrollgruppe wurde durch gesunde Patienten repräsentiert Stichprobengröße

Die Berechnung des Stichprobenumfangs erfolgte nach folgender Formel:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Mit N=30, Z=2,46 (99 % Vertrauen), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95 % Genauigkeit). Die Stichprobengröße umfasste 20 Patienten mit RA.

Anthropometrische Messungen Gewicht (kg) und Größe (m) wurden in einer mechanischen Säulenwaage (SECA) berechnet. Die Patienten wurden nach ihrem Body-Mass-Index (BMI, Gewicht (kg)/ Körpergröße (m)2) als a) Normalgewicht (BMI < 24,9), b) Übergewicht (24,9 kg/m2 < BMI < 29,9) eingeteilt kg/m2) und c) fettleibig (BMI > 30 kg/m2).

Lymphozytenextraktion Lymphozyten aus peripherem Blut wurden unter Verwendung des ACK Lysing Buffer ® (Life Technologies, Grand Island, NY)-Kit extrahiert. Kurz gesagt, eine venöse Blutprobe in einem EDTA-Röhrchen (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ) wurde bei 3500 U/min für 5–8 Minuten zentrifugiert. Die resultierende weiß gefärbte Zwischenphase wurde extrahiert und in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben; 1 ml ACK Lysing Buffer® wurde hinzugefügt und vorsichtig resuspendiert. Noch einmal wurde die Suspension bei 3500 U/min für 5–8 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Dieser letzte Schritt wurde wiederholt, bis die Leukozytenpackung vollständig weiß war. Schließlich wurden 100 mcl ACK Lysing Buffer® hinzugefügt und für die spätere Verwendung bei –70 °C eingefroren.

Genetische Expression Aus dem Leukozytenpaket (ungefähr 10 bis 15 mg) wurde eine Boten-RNA (mRNA)-Extraktion unter Verwendung des Magna Pure LC RNA-Isolierungskits III (Roche) im Magna Pure LC 2.0 Instrument durchgeführt. Das Absorptionsverhältnis A260/A280 nm war > 1,8 (Qualität) und die Gesamt-RNA-Konzentration wurde durch Bestimmung der Absorption bei 260 nm berechnet, die mit dem NanoPhotometer (Implen GmbH, Deutschland) ermittelt wurde, und die Extrakte wurden auf eine Konzentration von 20 &mgr;g DNA für die eingestellt PCR-Reaktion.

Anschließend wurde die cDNA mit dem Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science) synthetisiert. Es wurde eine Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) unter Verwendung der spezifischen Primer und Sonden für NF-KB1, IKK epsilon und 18s (als konstitutives Gen) unter Verwendung eines 7500 Fast Real Time PCR-Systems (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire) durchgeführt , UK), Mischen des TaqMan® Universal PCR Master Mix und der spezifischen Sonden für jedes Gen NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) und 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , Großbritannien).

Gemäß dem von den beiden unterschiedlichen Gruppen erhaltenen Ct wurden die relativen Expressionseinheiten durch das relative Quantifizierungsverfahren von Pfaffl berechnet, bei dem ein gesunder Patient als Kontrolle verwendet wurde.

Statistische Analyse Die statistische Analyse wurde mit der Sigmaplot-Softwareversion 12.0 durchgeführt. Parametrische und nicht-parametrische Tests wurden in Abhängigkeit von der variablen Verteilung verwendet: unter den parametrischen Tests, die durchgeführt wurden, um die Gruppen zu vergleichen, war der Student-T-Test enthalten; Die angewendeten nichtparametrischen Tests waren: Der Mann-Whitney-U-Test und der Shapiro-Wilk-Test. Schließlich wurde ein Receiver Operating Characteristic (ROC) für die Analyse der genetischen Expression von NF-KB1/IKK epsilon mit der SPSS-Softwareversion 22.0 verwendet.