NFKB1 ja IKK Epsilon nivelreumassa (NUIRA)

Potilaat, joilla oli vahvistettu RA-diagnoosi, jaettiin kahteen ryhmään sairauden aktiivisuuspisteen 28 (DAS28) perusteella: a) kliininen aktiivisuus ja b) kliininen remissio. Tärkeimmät poissulkemiskriteerit olivat potilaat, joilla oli jokin muu tulehduksellinen tai autoimmuunisairaus, ja potilaat, joilla oli infektioita. Kontrolliryhmää edustivat terveet potilaat Näytteen koko

Otoskoon laskeminen suoritettiin seuraavan kaavan avulla:

n = Nz2pq/d2(N-1) +z2pq Kun N = 30, Z = 2,46 (99 % luotettavuudesta), p = 0,9, q = 0,1, d = 0,05 (95 % tarkkuudesta). Otoskoko sisälsi 20 nivelreumapotilasta.

Antropometriset mittaukset Paino (kg) ja korkeus (m) laskettiin mekaanisessa pylväsasteikossa (SECA). Potilaat luokiteltiin heidän painoindeksinsä (BMI, paino (kg)/pituus (m)2) mukaan a) normaalipainoon (BMI< 24,9), b) ylipainoiseen (24,9 kg/m2 <BMI<29,9). kg/m2) ja c) lihavia (BMI > 30 kg/m2).

Lymfosyyttien uuttaminen Lymfosyytit perifeerisestä verestä uutettiin käyttämällä ACK Lysing Buffer® -pakkausta (Life technologies, Grand Island, NY). Lyhyesti sanottuna laskimoverinäyte EDTA-putkessa (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ) sentrifugoitiin nopeudella 3500 rpm 5-8 minuutin ajan. Tuloksena saatu valkoinen värillinen välifaasi uutettiin ja laitettiin eppendorf-putkeen; 1 ml ACK Lysing Buffer®:a lisättiin ja suspendoitiin varovasti uudelleen. Jälleen kerran suspensiota sentrifugoitiin nopeudella 3500 rpm 5-8 minuutin ajan ja supernatantti heitettiin pois. Tämä viimeinen vaihe toistettiin, kunnes leukosyyttipakkaus oli täysin valkoinen. Lopuksi siihen lisättiin 100 mcl ACK Lysing Buffer® -puskuria ja pakastettiin -70 ºC:seen myöhempää käyttöä varten.

Geneettinen ilmentyminen Leukosyyttipakkauksesta (noin 10-15 mg) suoritettiin lähetti-RNA:n (mRNA) uutto käyttämällä Magna Pure LC RNA:n eristyspakkausta III (Roche) Magna Pure LC 2.0 Instrumentissa. A260/A280 nm:n absorbanssisuhde oli >1,8 (laatu) ja RNA:n kokonaispitoisuus laskettiin määrittämällä absorbanssi aallonpituudella 260 nm, joka oli määritetty NanoPhotometerilla (Implen GmbH, Saksa) ja uutteet säädettiin 20 µg:n DNA:n pitoisuuteen. PCR-reaktio.

Tämän jälkeen cDNA syntetisoitiin Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit -pakkauksella (Roche Applied Science). Se suoritettiin reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qPCR) käyttämällä spesifisiä alukkeita ja koettimia NF-KB1:lle, IKK epsilonille ja 18s:lle (konstitutiivisena geeninä) käyttäen 7500 Fast Real Time PCR -järjestelmää (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , Yhdistynyt kuningaskunta), sekoittamalla TaqMan® Universal PCR Master Mix ja kunkin geenin spesifiset koettimet NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) ja 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Cheshire , Iso-Britannia).

Kahdesta eri ryhmästä saadun Ct:n mukaan suhteelliset ilmentymisyksiköt laskettiin Pfafflin suhteellisella kvantifiointimenetelmällä, jossa sitä käytettiin terveen potilaan kontrollina.

Tilastollinen analyysi Tilastollinen analyysi suoritettiin Sigmaplot-ohjelmistoversiolla 12.0. Parametrista ja ei-parametrista testiä käytettiin muuttujajakauman funktiona: ryhmien vertailua varten suoritettujen parametristen testien joukossa oli Studentin T-testi; käytetyt ei-parametriset testit olivat: Mann-Whitney U -testi ja Shapiro-Wilk -testi. Lopuksi vastaanottimen toimintaominaisuus (ROC) käytettiin NF-KB1/IKK epsilonin geneettisen ilmentymisen analysointiin SPSS-ohjelmistoversiolla 22.0.