NFKB1 og IKK Epsilon ved revmatoid artritt (NUIRA)

Pasienter med bekreftet diagnose av RA ble fordelt i to grupper basert på Disease Activity Score 28 (DAS28): a) med klinisk aktivitet og b) med klinisk remisjon. Viktige eksklusjonskriterier var pasienter med annen inflammatorisk eller autoimmun sykdom og pasienter med infeksjoner. Kontrollgruppen var representert av friske pasienter. Prøvestørrelse

Prøvestørrelsesberegningen ble utført ved hjelp av følgende formel:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Med N=30, Z=2,46 (99% av konfidens), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% av nøyaktighet). Prøvestørrelsen inneholdt 20 pasienter med RA.

Antropometriske mål Vekt (kg) og høyde (m) ble beregnet i en mekanisk kolonneskala (SECA). Pasientene ble klassifisert i henhold til deres kroppsmasseindeks (BMI, vekt (Kg)/høyde (m)2) som a) normalvekt (BMI<24,9), b) overvekt (24,9 kg/m2 <BMI<29,9) kg/m2) og c) overvektige (BMI> 30 kg/m2).

Lymfocyttekstraksjon Lymfocytter fra perifert blod ble ekstrahert ved å bruke ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY)-settet. Kort fortalt ble en venøs blodprøve i EDTA-rør (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ), sentrifugert ved 3500 rpm i løpet av 5-8 minutter. Den resulterende mellomliggende hvitfargede fasen ble ekstrahert og plassert i et Eppendorf-rør; 1 mL ACK Lysing Buffer® ble tilsatt og forsiktig resuspendert. Nok en gang ble suspensjonen sentrifugert ved 3500 rpm i løpet av 5-8 minutter og supernatanten ble kastet. Dette siste trinnet ble gjentatt til leukocyttpakken var helt hvit. Til slutt ble det tilsatt 100 mcl ACK Lysing Buffer® og frosset ved -70ºC for senere bruk.

Genetisk ekspresjon Fra leukocyttpakken (ca. 10 til 15 mg) ble det utført en messenger RNA (mRNA) ekstraksjon ved bruk av Magna Pure LC RNA isolasjonssett III (Roche) i Magna Pure LC 2.0 Instrument. Absorbansforholdet A260/A280 nm var >1,8 (kvalitet) og total RNA-konsentrasjon ble beregnet ved å bestemme absorbansen ved 260 nm etablert med NanoPhotometer (Implen GmbH, Tyskland) og ekstraktene ble justert til en konsentrasjon på 20 µg DNA for PCR-reaksjon.

Deretter ble cDNA syntetisert med Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). Det ble utført en sanntids polymerasekjedereaksjon (qPCR), ved bruk av de spesifikke primerne og probene for NF-KB1, IKK epsilon og 18s (som konstitutivt gen), ved bruk av et 7500 Fast Real Time PCR-system (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire) , Storbritannia), blande TaqMan® Universal PCR Master Mix og de spesifikke probene for hvert gen NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) og 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire, UK, Cheshire , Storbritannia).

I henhold til Ct oppnådd fra de to forskjellige gruppene ble det beregnet de relative uttrykksenhetene gjennom Pfaffl relative kvantifiseringsmetode, der den ble brukt som kontroll for en frisk pasient.

Statistisk analyse Den statistiske analysen ble utført gjennom Sigmaplot programvareversjon 12.0. Parametrisk og ikke-parametrisk test ble brukt i funksjon til variabelfordelingen: blant de parametriske testene som ble utført for å sammenligne gruppene, ble studentens T-test inkludert; de ikke-parametriske testene som ble brukt var: Mann-Whitney U-testen og Shapiro-Wilk-testen. Til slutt ble en mottakeroperasjonskarakteristikk (ROC) brukt for analyse av det genetiske uttrykket av NF-KB1/IKK epsilon med SPSS-programvareversjon 22.0.