関節リウマチにおけるNFKB1とIKKイプシロン (NUIRA)

RAの診断が確認された患者は、疾患活動性スコア28（DAS28）に基づいて2つのグループに割り当てられました：a）臨床活動がある患者とb）臨床的寛解がある患者。 重要な除外基準は、他の炎症性疾患または自己免疫疾患の患者、および感染症の患者でした。 対照群は健康な患者で代表された サンプルサイズ

サンプルサイズの計算は、次の式を使用して実行されました。

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq N=30、Z=2.46 (信頼度 99%)、p=0.9、q=0.1、d=0.05 (精度 95%) の場合。 サンプルサイズには 20 人の RA 患者が含まれていました。

人体測定 重量 (kg) と高さ (m) は、機械式柱秤 (SECA) で計算されました。 患者は、肥満度指数 (BMI、体重 (Kg)/身長 (m)2) に従って、a) 標準体重 (BMI < 24.9)、b) 過体重 (24.9 kg/m2 < BMI < 29.9) として分類されました。 kg/m2) および c) 肥満 (BMI > 30 kg/m2)。

リンパ球の抽出 ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY) キットを使用して、末梢血からリンパ球を抽出しました。 手短に言えば、ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中の静脈血サンプルを３５００ｒｐｍで５～８分間遠心分離した。 得られた中間白色相を抽出し、エッペンドルフチューブに入れた。 1 mL の ACK Lysing Buffer® を加え、慎重に再懸濁しました。 再度、懸濁液を３５００ｒｐｍで５～８分間遠心分離し、上清を捨てた。 白血球パッケージが完全に白くなるまで、この最後のステップを繰り返した。 最後に、100 mcl の ACK Lysing Buffer® を加え、後で使用するために -70ºC で凍結しました。

遺伝子発現 白血球パッケージ (約 10 ～ 15 mg) から、Magna Pure LC 2.0 Instrument で Magna Pure LC RNA 分離キット III (Roche) を使用してメッセンジャー RNA (mRNA) 抽出を行いました。 A260/A280 nm の吸光度比は >1.8 (品質) であり、NanoPhotometer (Implen GmbH、ドイツ) で確立された 260 nm での吸光度を決定することによって総 RNA 濃度を計算し、抽出物を 20 μg の DNA 濃度に調整しました。 PCR反応。

続いて、Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science)を用いてcDNAを合成した。 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire 、英国)、TaqMan® Universal PCR Master Mix と、各遺伝子 NF-KB1 (Hs00765730-m1)、IKK イプシロン (Hs01063858-m1)、および 18S (Hs99999901-s1) に特異的なプローブを混合 (Applied Biosystems、Applera UK、チェシャー) 、 イギリス）。

2 つの異なるグループから得られた Ct に従って、Pfaffl 相対定量法によって相対発現単位が計算され、健康な患者のコントロールとして使用されました。

統計分析 統計分析は、Sigmaplot ソフトウェア バージョン 12.0 を介して実行されました。 パラメトリック検定とノンパラメトリック検定は、変数分布の関数として使用されました。グループを比較するために実行されたパラメトリック検定には、スチューデントの T 検定が含まれていました。適用されたノンパラメトリック検定は、Mann-Whitney U 検定と Shapiro-Wilk 検定です。 最後に、SPSS ソフトウェア バージョン 22.0 を使用した NF-KB1/IKK イプシロンの遺伝子発現の分析には、受信者動作特性 (ROC) が使用されました。