NFKB1 e IKK Epsilon nell'artrite reumatoide (NUIRA)

I pazienti con diagnosi confermata di AR sono stati assegnati in due gruppi in base al punteggio di attività della malattia 28 (DAS28): a) con attività clinica eb) con remissione clinica. I criteri chiave di esclusione erano pazienti con qualsiasi altra malattia infiammatoria o autoimmune e pazienti con infezioni. Il gruppo di controllo era rappresentato da pazienti sani Dimensione del campione

Il calcolo della dimensione del campione è stato effettuato attraverso la seguente formula:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Con N=30, Z=2.46 (99% di confidenza), p=0.9, q=0.1, d=0.05 (95% di accuratezza). La dimensione del campione conteneva 20 pazienti con AR.

Misure antropometriche Il peso (kg) e l'altezza (m) sono stati calcolati con una bilancia meccanica a colonna (SECA). I pazienti sono stati classificati in base al loro indice di massa corporea (BMI, peso (Kg)/altezza (m)2) come a) peso normale (BMI<24,9), b) sovrappeso (24,9 kg/m2 <BMI<29,9 kg/m2) e c) obesi (BMI> 30 kg/m2).

Estrazione dei linfociti I linfociti dal sangue periferico sono stati estratti utilizzando il kit ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY). In breve, un campione di sangue venoso in una provetta EDTA (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ), è stato centrifugato a 3500 rpm per 5-8 minuti. La risultante fase intermedia di colore bianco è stata estratta e posta in una provetta eppendorf; 1 mL di ACK Lysing Buffer® è stato aggiunto e risospeso con cura. Ancora una volta, la sospensione è stata centrifugata a 3500 rpm per 5-8 minuti e il surnatante è stato scartato. Quest'ultimo passaggio è stato ripetuto fino a quando il pacchetto di leucociti era completamente bianco. Infine, sono stati aggiunti 100 mcl di ACK Lysing Buffer® e congelato a -70ºC per un uso successivo.

Espressione genetica Dalla confezione dei leucociti (da 10 a 15 mg circa), è stata eseguita un'estrazione dell'RNA messaggero (mRNA) utilizzando il kit di isolamento dell'RNA Magna Pure LC III (Roche) nello strumento Magna Pure LC 2.0. Il rapporto di assorbanza A260/A280 nm era >1,8 (qualità) e la concentrazione totale di RNA è stata calcolata determinando l'assorbanza a 260 nm stabilita con il NanoPhotometer (Implen GmbH, Germania) e gli estratti sono stati regolati a una concentrazione di 20 µg di DNA per il Reazione PCR.

Successivamente, il cDNA è stato sintetizzato con il Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). È stata eseguita una reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR), utilizzando i primer e le sonde specifici per NF-KB1, IKK epsilon e 18s (come gene costitutivo), utilizzando un sistema 7500 Fast Real Time PCR (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , Regno Unito), mescolando TaqMan® Universal PCR Master Mix e le sonde specifiche per ciascun gene NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) e 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , UK).

In base al Ct ottenuto dai due diversi gruppi è stata calcolata l'unità di espressione relativa attraverso il metodo di quantificazione relativa Pfaffl, in cui è stato utilizzato come controllo un paziente sano.

Analisi statistica L'analisi statistica è stata effettuata tramite il software Sigmaplot versione 12.0. Sono stati utilizzati test parametrici e non parametrici in funzione della distribuzione delle variabili: tra i test parametrici che sono stati eseguiti per confrontare i gruppi, è stato incluso il test T di Student; i test non parametrici applicati sono stati: il test U di Mann-Whitney e il test di Shapiro-Wilk. Infine, è stata utilizzata una caratteristica operativa del ricevitore (ROC) per l'analisi dell'espressione genetica di NF-KB1/IKK epsilon con il software SPSS versione 22.0.