NFKB1 és IKK Epsilon rheumatoid arthritisben (NUIRA)

Az RA megerősített diagnózisával rendelkező betegeket a Disease Activity Score 28 (DAS28) alapján két csoportba osztották: a) klinikai aktivitással és b) klinikai remisszióval. A kulcsfontosságú kizárási kritériumok bármely más gyulladásos vagy autoimmun betegségben szenvedő és fertőzéses betegek voltak. A kontrollcsoportot az egészséges betegek mintanagysága képviselte

A minta méretének kiszámítása a következő képlettel történt:

n=Nz2pq/d2(N-1)+z2pq N=30, Z=2,46 (a megbízhatóság 99%-a), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95%-os pontosság). A minta 20 RA-s beteget tartalmazott.

Antropometriai mérések A súlyt (kg) és a magasságot (m) mechanikus oszlopskálán (SECA) számítottuk ki. A betegeket testtömeg-indexük (BMI, testtömeg (kg)/magasság (m)2) szerint osztályozták: a) normál súly (BMI< 24,9), b) túlsúly (24,9 kg/m2 <BMI<29,9). kg/m2) és c) elhízott (BMI> 30 kg/m2).

Limfociták kivonása A limfocitákat a perifériás vérből az ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY) kit segítségével extraháltuk. Röviden, egy vénás vérmintát EDTA-csőben (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ) centrifugáltunk 3500 fordulat/perc sebességgel 5-8 percig. A kapott fehér színű közbenső fázist extraháljuk és egy eppendorf-csőbe helyezzük; 1 ml ACK Lysing Buffer®-t adtunk hozzá, és óvatosan újraszuszpendáltuk. A szuszpenziót ismét 3500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 5-8 percig, és a felülúszót elöntöttük. Ezt az utolsó lépést addig ismételtük, amíg a leukocitacsomag teljesen fehér nem lett. Végül hozzáadtunk 100 mcl ACK Lysing Buffer®-t, és -70 °C-on lefagyasztottuk későbbi felhasználás céljából.

Genetikai expresszió A leukocita csomagból (körülbelül 10-15 mg) hírvivő RNS (mRNS) extrakciót végeztünk a Magna Pure LC RNS izolációs kit III (Roche) segítségével a Magna Pure LC 2.0 műszerben. Az A260/A280 nm-es abszorbancia arány >1,8 (minőség), és a teljes RNS-koncentrációt a NanoPhotometer (Implen GmbH, Németország) 260 nm-es abszorbancia meghatározásával számítottuk ki, és a kivonatokat 20 µg DNS-koncentrációra állítottuk be. PCR reakció.

Ezt követően a cDNS-t a Transcriptor High Fidelity cDNS Synthesis Kit-tel (Roche Applied Science) szintetizáltuk. Valós idejű polimeráz láncreakciót (qPCR) hajtottak végre az NF-KB1, IKK epsilon és 18s specifikus primerek és próbák (mint konstitutív gén) felhasználásával, egy 7500 Fast Real Time PCR rendszer (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire) segítségével. , Egyesült Királyság), a TaqMan® Universal PCR Master Mix és az egyes génekhez tartozó specifikus próbák összekeverésével: NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) és 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Cheshire , Egyesült Királyság).

A két különböző csoportból nyert Ct alapján a Pfaffl relatív kvantifikációs módszerrel számítottuk ki az expresszió relatív egységeit, amelyben egészséges beteg kontrolljaként használtuk.

Statisztikai elemzés A statisztikai elemzés a Sigmaplot szoftver 12.0-s verziójával történt. Paraméteres és nem paraméteres tesztet használtunk a változó eloszlás függvényében: a csoportok összehasonlítására végzett parametrikus tesztek között szerepelt a Student-féle T-próba is; az alkalmazott nem-paraméteres tesztek a következők voltak: Mann-Whitney U teszt és Shapiro-Wilk teszt. Végül egy vevő működési karakterisztikát (ROC) használtunk az NF-KB1/IKK epsilon genetikai expressziójának elemzésére az SPSS szoftver 22.0 verziójával.