NFKB1 e IKK Epsilon na Artrite Reumatoide (NUIRA)

Os pacientes com diagnóstico confirmado de AR foram alocados em dois grupos com base no Disease Activity Score 28 (DAS28): a) com atividade clínica eb) com remissão clínica. Os principais critérios de exclusão foram pacientes com qualquer outra doença inflamatória ou autoimune e pacientes com infecções. O grupo controle foi representado por pacientes saudáveis ​​Tamanho da amostra

O cálculo do tamanho da amostra foi realizado através da seguinte fórmula:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Com N=30, Z=2,46 (99% de confiança), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% de precisão). O tamanho da amostra continha 20 pacientes com AR.

Medidas antropométricas O peso (kg) e a altura (m) foram calculados em balança mecânica de coluna (SECA). Os pacientes foram classificados de acordo com seu índice de massa corporal (IMC, peso (Kg)/altura (m)2) como a) peso normal (IMC< 24,9), b) excesso de peso (24,9 kg/m2 <IMC<29,9 kg/m2) ec) obesos (IMC > 30 kg/m2).

Extração de linfócitos Os linfócitos do sangue periférico foram extraídos usando o kit ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY). Resumidamente, uma amostra de sangue venoso em tubo EDTA (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ), foi centrifugada a 3500 rpm durante 5-8 minutos. A fase intermediária de cor branca resultante foi extraída e colocada em um tubo eppendorf; 1 mL de ACK Lysing Buffer® foi adicionado e cuidadosamente ressuspenso. Mais uma vez, a suspensão foi centrifugada a 3500 rpm durante 5-8 minutos e o sobrenadante foi descartado. Este último passo foi repetido até que o pacote de leucócitos estivesse completamente branco. Por fim, adicionou-se 100 mcl de ACK Lysing Buffer® e congelou-se a -70ºC para posterior utilização.

Expressão genética A partir do pacote de leucócitos (aproximadamente 10 a 15 mg), foi realizada uma extração de RNA mensageiro (mRNA) usando o kit de isolamento Magna Pure LC RNA III (Roche) no Instrumento Magna Pure LC 2.0. A razão de absorbância A260/A280 nm foi >1,8 (qualidade) e a concentração de RNA total foi calculada determinando a absorbância a 260 nm estabelecida com o NanoPhotometer (Implen GmbH, Alemanha) e os extratos foram ajustados para uma concentração de 20 µg de DNA para o reação de PCR.

Subsequentemente, o cDNA foi sintetizado com o Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). Foi realizada uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), usando os primers e sondas específicos para NF-KB1, IKK epsilon e 18s (como gene constitutivo), usando um sistema 7500 Fast Real Time PCR (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , Reino Unido), misturando TaqMan® Universal PCR Master Mix e as sondas específicas para cada gene NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) e 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , Reino Unido).

De acordo com a Ct obtida dos dois diferentes grupos, foram calculadas as unidades relativas de expressão através do método de quantificação relativa Pfaffl, no qual foi utilizado como controle um paciente saudável.

Análise estatística A análise estatística foi realizada por meio do software Sigmaplot versão 12.0. Foram utilizados testes paramétricos e não paramétricos em função da distribuição das variáveis: dentre os testes paramétricos que foram realizados para comparar os grupos, foi incluído o teste t de Student; os testes não paramétricos aplicados foram: Mann-Whitney U test e Shapiro-Wilk test. Finalmente, uma característica de operação do receptor (ROC) foi utilizada para a análise da expressão genética de NF-KB1/IKK epsilon com o software SPSS versão 22.0.