NFKB1 и IKK Epsilon при ревматоидном артрите (NUIRA)

Пациенты с подтвержденным диагнозом РА были распределены на две группы на основании шкалы активности заболевания 28 (DAS28): а) с клинической активностью и б) с клинической ремиссией. Ключевыми критериями исключения были пациенты с любым другим воспалительным или аутоиммунным заболеванием и пациенты с инфекциями. Контрольную группу составили здоровые пациенты Размер выборки

Расчет объема выборки проводился по следующей формуле:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq С N=30, Z=2,46 (99% достоверности), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% достоверности). Объем выборки составил 20 пациентов с РА.

Антропометрические измерения Вес (кг) и рост (м) рассчитывали по шкале механической колонки (SECA). Пациенты были классифицированы в соответствии с индексом массы тела (ИМТ, ​​вес (кг)/рост (м)2) как а) нормальный вес (ИМТ<24,9), б) избыточный вес (24,9 кг/м2 <ИМТ<29,9). кг/м2) и в) страдающие ожирением (ИМТ > 30 кг/м2).

Экстракция лимфоцитов Лимфоциты из периферической крови экстрагировали с использованием набора ACK Lysing Buffer® (Life Technologies, Grand Island, NY). Вкратце, образец венозной крови в пробирке с ЭДТА (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ) центрифугировали при 3500 об/мин в течение 5-8 минут. Полученную промежуточную фазу белого цвета экстрагировали и помещали в пробирку Эппендорфа; Добавляли 1 мл лизирующего буфера ACK Lysing Buffer® и тщательно ресуспендировали. Суспензию повторно центрифугировали при 3500 об/мин в течение 5-8 минут и отбрасывали надосадочную жидкость. Этот последний этап повторяли до тех пор, пока пакет лейкоцитов не становился полностью белым. Наконец, к нему добавили 100 мкл лизирующего буфера ACK Lysing Buffer® и заморозили при -70ºC для последующего использования.

Генетическая экспрессия Из пакета лейкоцитов (приблизительно 10–15 мг) была проведена экстракция матричной РНК (мРНК) с использованием набора для выделения РНК Magna Pure LC III (Roche) в приборе Magna Pure LC 2.0. Отношение оптической плотности A260/A280 нм составляло >1,8 (качество), а общую концентрацию РНК рассчитывали путем определения оптической плотности при 260 нм, установленной с помощью нанофотометра (Implen GmbH, Германия), и экстракты доводили до концентрации 20 мкг ДНК для ПЦР реакция.

Затем кДНК синтезировали с помощью набора для синтеза кДНК Transcriptor High Fidelity (Roche Applied Science). Была проведена полимеразная цепная реакция в реальном времени (qPCR) с использованием специфических праймеров и зондов для NF-KB1, IKK epsilon и 18s (в качестве конститутивного гена) с использованием системы быстрой ПЦР в реальном времени 7500 (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire). , Великобритания), смешивая TaqMan® Universal PCR Master Mix и специальные зонды для каждого гена NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) и 18S (Hs99999901-s1) (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , ВЕЛИКОБРИТАНИЯ).

Согласно Ct, полученному из двух разных групп, рассчитывали относительные единицы экспрессии с помощью метода относительного количественного определения Pfaffl, в котором его использовали в качестве контроля для здорового пациента.

Статистический анализ Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения Sigmaplot версии 12.0. Параметрический и непараметрический тесты использовались в зависимости от распределения переменных: среди параметрических тестов, проведенных для сравнения групп, был включен Т-критерий Стьюдента; применялись непараметрические тесты: U-критерий Манна-Уитни и критерий Шапиро-Уилка. Наконец, рабочая характеристика приемника (ROC) использовалась для анализа генетической экспрессии эпсилон NF-KB1/IKK с помощью программного обеспечения SPSS версии 22.0.