NFKB1 et IKK Epsilon dans la polyarthrite rhumatoïde (NUIRA)

Les patients avec un diagnostic confirmé de PR ont été répartis en deux groupes sur la base du score d'activité de la maladie 28 (DAS28) : a) avec une activité clinique et b) avec une rémission clinique. Les principaux critères d'exclusion étaient les patients atteints de toute autre maladie inflammatoire ou auto-immune et les patients atteints d'infections. Le groupe témoin était représenté par des patients en bonne santé Taille de l'échantillon

Le calcul de la taille de l'échantillon a été effectué à l'aide de la formule suivante :

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Avec N=30, Z=2,46 (99% de confiance), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% de précision). La taille de l'échantillon contenait 20 patients atteints de PR.

Mesures anthropométriques Le poids (kg) et la taille (m) ont été calculés sur une balance mécanique à colonne (SECA). Les patients ont été classés selon leur indice de masse corporelle (IMC, poids (Kg)/taille (m)2) comme a) poids normal (IMC < 24,9), b) surpoids (24,9 kg/m2 < IMC <29,9 kg/m2) et c) obèses (IMC> 30 kg/m2).

Extraction des lymphocytes Les lymphocytes du sang périphérique ont été extraits à l'aide du kit ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY). En bref, un échantillon de sang veineux dans un tube EDTA (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ), a été centrifugé à 3500 tr/min pendant 5 à 8 minutes. La phase intermédiaire colorée en blanc résultante a été extraite et placée dans un tube eppendorf ; 1 mL de ACK Lysing Buffer® a été ajouté et soigneusement remis en suspension. Une fois de plus, la suspension a été centrifugée à 3500 tr/min pendant 5 à 8 minutes et le surnageant a été jeté. Cette dernière étape a été répétée jusqu'à ce que le paquet de leucocytes soit complètement blanc. Enfin, il a été ajouté 100 mcl d'ACK Lysing Buffer® et congelé à -70°C pour une utilisation ultérieure.

Expression génétique À partir du paquet leucocytaire (environ 10 à 15 mg), une extraction de l'ARN messager (ARNm) a été effectuée à l'aide du kit d'isolement d'ARN Magna Pure LC III (Roche) dans l'instrument Magna Pure LC 2.0. Le rapport d'absorbance A260/A280 nm était > 1,8 (qualité) et la concentration d'ARN total a été calculée en déterminant l'absorbance à 260 nm établie avec le NanoPhotometer (Implen GmbH, Allemagne) et les extraits ont été ajustés à une concentration de 20 µg d'ADN pour le Réaction PCR.

Ensuite, l'ADNc a été synthétisé avec le kit de synthèse d'ADNc haute fidélité Transcriptor (Roche Applied Science). Il a été réalisé une réaction en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR), en utilisant les amorces et les sondes spécifiques pour NF-KB1, IKK epsilon et 18s (comme gène constitutif), en utilisant un système de PCR en temps réel rapide 7500 (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , UK), en mélangeant TaqMan® Universal PCR Master Mix et les sondes spécifiques pour chaque gène NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) et 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , ROYAUME-UNI).

Selon le Ct obtenu à partir des deux groupes différents, les unités d'expression relatives ont été calculées par la méthode de quantification relative Pfaffl, dans laquelle il a été utilisé comme témoin un patient sain.

Analyse statistique L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel Sigmaplot version 12.0. Des tests paramétriques et non paramétriques ont été utilisés en fonction de la distribution des variables : parmi les tests paramétriques qui ont été effectués pour comparer les groupes, le test T de Student a été inclus ; les tests non paramétriques appliqués étaient : le test U de Mann-Whitney et le test de Shapiro-Wilk. Enfin, une caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC) a été utilisée pour l'analyse de l'expression génétique de NF-KB1/IKK epsilon avec le logiciel SPSS version 22.0.