NFKB1 och IKK Epsilon vid reumatoid artrit (NUIRA)

Patienter med en bekräftad diagnos av RA fördelades i två grupper baserat på Disease Activity Score 28 (DAS28): a) med klinisk aktivitet och b) med klinisk remission. Viktiga uteslutningskriterier var patienter med någon annan inflammatorisk eller autoimmun sjukdom och patienter med infektioner. Kontrollgruppen representerades av friska patienter. Provstorlek

Beräkningen av provstorleken utfördes med följande formel:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Med N=30, Z=2,46 (99% av konfidens), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% av noggrannhet). Provstorleken innehöll 20 patienter med RA.

Antropometriska mått Vikt (kg) och höjd (m) beräknades i en mekanisk kolumnskala (SECA). Patienterna klassificerades enligt deras Body mass index (BMI, vikt (Kg)/längd (m)2) som a) normalvikt (BMI<24,9), b) övervikt (24,9 kg/m2 <BMI<29,9) kg/m2) och c) fetma (BMI> 30 kg/m2).

Lymfocytextraktion Lymfocyter från perifert blod extraherades med hjälp av ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY). Kortfattat centrifugerades ett venöst blodprov i EDTA-rör (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ), vid 3500 rpm under 5-8 minuter. Den resulterande mellanliggande vitfärgade fasen extraherades och placerades i ett Eppendorf-rör; 1 ml ACK Lysing Buffer® tillsattes och återsuspenderades försiktigt. Än en gång centrifugerades suspensionen vid 3500 rpm under 5-8 minuter och supernatanten kasserades. Detta sista steg upprepades tills leukocytpaketet var helt vitt. Slutligen tillsattes 100 mcl ACK Lysing Buffer® och frystes vid -70ºC för senare användning.

Genetiskt uttryck Från leukocytpaketet (ungefär 10 till 15 mg) utfördes en budbärar-RNA (mRNA)-extraktion med användning av Magna Pure LC RNA-isoleringskit III (Roche) i Magna Pure LC 2.0-instrumentet. Absorbansförhållandet A260/A280 nm var >1,8 (kvalitet) och den totala RNA-koncentrationen beräknades genom att bestämma absorbansen vid 260 nm fastställd med NanoPhotometer (Implen GmbH, Tyskland) och extrakten justerades till en koncentration av 20 µg DNA för PCR-reaktion.

Därefter syntetiserades cDNA med Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). Det utfördes en polymeraskedjereaktion i realtid (qPCR), med användning av de specifika primrarna och sonderna för NF-KB1, IKK epsilon och 18s (som konstitutiv gen), med användning av ett 7500 Fast Real Time PCR-system (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire) , Storbritannien), blanda TaqMan® Universal PCR Master Mix och de specifika sonderna för varje gen NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) och 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , STORBRITANNIEN).

Enligt Ct erhållet från de två olika grupperna beräknades de relativa uttrycksenheterna genom Pfaffls relativa kvantifieringsmetod, där den användes som kontroll för en frisk patient.

Statistisk analys Den statistiska analysen utfördes genom Sigmaplot-programvaran version 12.0. Parametriska och icke-parametriska test användes i funktion till variabelfördelningen: bland det parametriska testet som utfördes för att jämföra grupperna inkluderades Students T-test; de icke-parametriska testerna som användes var: Mann-Whitney U-testet och Shapiro-Wilk-testet. Slutligen användes en mottagarfunktionskarakteristik (ROC) för analys av det genetiska uttrycket av NF-KB1/IKK epsilon med SPSS-programvaruversion 22.0.