NFKB1 i IKK Epsilon w reumatoidalnym zapaleniu stawów (NUIRA)

Pacjenci z potwierdzonym rozpoznaniem RZS zostali podzieleni na dwie grupy na podstawie oceny aktywności choroby 28 (DAS28): a) z aktywnością kliniczną ib) z remisją kliniczną. Kluczowymi kryteriami wykluczenia byli pacjenci z jakąkolwiek inną chorobą zapalną lub autoimmunologiczną oraz pacjenci z infekcjami. Grupę kontrolną stanowili zdrowi pacjenci. Wielkość próby

Liczebność próby obliczono według następującego wzoru:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Przy N=30, Z=2,46 (99% pewności), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% dokładności). Wielkość próby obejmowała 20 pacjentów z RZS.

Pomiary antropometryczne Masę (kg) i wzrost (m) obliczono w mechanicznej skali kolumnowej (SECA). Pacjentów sklasyfikowano na podstawie wskaźnika masy ciała (BMI, waga (kg)/wzrost (m)2) jako a) prawidłowa masa ciała (BMI < 24,9), b) nadwaga (24,9 kg/m2 < BMI < 29,9) kg/m2) oraz c) otyłych (BMI > 30 kg/m2).

Ekstrakcja limfocytów Limfocyty z krwi obwodowej ekstrahowano przy użyciu zestawu ACK Lysing Buffer® (Life Technologies, Grand Island, NY). Pokrótce, próbkę krwi żylnej w probówce z EDTA (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ) wirowano przy 3500 obr./min przez 5-8 minut. Otrzymaną fazę pośrednią o barwie białej ekstrahowano i umieszczono w probówce Eppendorfa; Dodano 1 ml ACK Lysing Buffer® i ostrożnie ponownie zawieszono. Ponownie zawiesinę odwirowano przy 3500 obr./min przez 5-8 minut i odrzucono supernatant. Ten ostatni krok powtarzano, aż pakiet leukocytów był całkowicie biały. Na koniec dodano 100 mcl ACK Lysing Buffer® i zamrożono w temperaturze -70ºC do późniejszego wykorzystania.

Ekspresja genetyczna Z pakietu leukocytów (w przybliżeniu 10 do 15 mg) przeprowadzono ekstrakcję informacyjnego RNA (mRNA) przy użyciu zestawu do izolacji Magna Pure LC RNA III (Roche) w aparacie Magna Pure LC 2.0. Stosunek absorbancji A260/A280 nm wynosił >1,8 (jakość), a całkowite stężenie RNA obliczono przez określenie absorbancji przy 260 nm ustalonej za pomocą NanoPhotometer (Implen GmbH, Niemcy), a ekstrakty doprowadzono do stężenia 20 µg DNA dla reakcja PCR.

Następnie cDNA zsyntetyzowano za pomocą zestawu Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). Przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR), stosując specyficzne startery i sondy dla NF-KB1, IKK epsilon i 18s (jako gen konstytutywny), stosując system 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , Wielka Brytania), mieszając TaqMan® Universal PCR Master Mix i specyficzne sondy dla każdego genu NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) i 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , Wielka Brytania).

Na podstawie Ct uzyskanej z dwóch różnych grup obliczono względne jednostki ekspresji metodą względnej ilościowej oceny Pfaffla, w której zastosowano ją jako kontrolę u zdrowego pacjenta.

Analiza statystyczna Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania Sigmaplot w wersji 12.0. Zastosowano testy parametryczne i nieparametryczne w zależności od rozkładu zmiennych: wśród testów parametrycznych, które przeprowadzono w celu porównania grup, uwzględniono test t-Studenta; zastosowano testy nieparametryczne: test U Manna-Whitneya i test Shapiro-Wilka. Ostatecznie do analizy ekspresji genetycznej NF-KB1/IKK epsilon użyto charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) za pomocą oprogramowania SPSS w wersji 22.0.