NFKB1 og IKK Epsilon i reumatoid arthritis (NUIRA)

Patienter med en bekræftet diagnose af RA blev fordelt i to grupper baseret på Disease Activity Score 28 (DAS28): a) med klinisk aktivitet og b) med klinisk remission. Nøgle eksklusionskriterier var patienter med enhver anden inflammatorisk eller autoimmun sygdom og patienter med infektioner. Kontrolgruppen var repræsenteret af raske patienter Prøvestørrelse

Prøvestørrelsesberegningen blev udført ved hjælp af følgende formel:

n= Nz2 pq/d2(N-1) +z2 pq Med N=30, Z=2,46 (99% af konfidens), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% af nøjagtighed). Prøvestørrelsen indeholdt 20 patienter med RA.

Antropometriske mål Vægt (kg) og højde (m) blev beregnet i en mekanisk søjleskala (SECA). Patienterne blev klassificeret efter deres kropsmasseindeks (BMI, vægt (Kg)/højde (m)2) som a) normalvægt (BMI<24,9), b) overvægt (24,9 kg/m2 <BMI<29,9) kg/m2) og c) overvægtige (BMI> 30 kg/m2).

Lymfocytekstraktion Lymfocytter fra perifert blod blev ekstraheret ved hjælp af ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY) kit. Kort fortalt blev en venøs blodprøve i EDTA-rør (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ) centrifugeret ved 3500 rpm i løbet af 5-8 minutter. Den resulterende mellemliggende hvidfarvede fase blev ekstraheret og anbragt i et Eppendorf-rør; 1 ml ACK Lysing Buffer® blev tilsat og omhyggeligt resuspenderet. Endnu en gang blev suspensionen centrifugeret ved 3500 rpm i 5-8 minutter, og supernatanten blev kasseret. Dette sidste trin blev gentaget, indtil leukocytpakken var fuldstændig hvid. Til sidst blev det tilsat 100 mcl ACK Lysing Buffer® og frosset ved -70ºC til senere brug.

Genetisk ekspression Fra leukocytpakken (ca. 10 til 15 mg) blev det udført en messenger RNA (mRNA) ekstraktion under anvendelse af Magna Pure LC RNA isolationskit III (Roche) i Magna Pure LC 2.0 Instrument. A260/A280 nm absorbansforholdet var >1,8 (kvalitet), og total RNA-koncentration blev beregnet ved at bestemme absorbans ved 260 nm etableret med NanoPhotometer (Implen GmbH, Tyskland), og ekstrakterne blev justeret til en koncentration på 20 µg DNA for PCR reaktion.

Efterfølgende blev cDNA'et syntetiseret med Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). Det blev udført en polymerasekædereaktion i realtid (qPCR), ved brug af de specifikke primere og prober for NF-KB1, IKK epsilon og 18s (som konstitutivt gen), ved brug af et 7500 Fast Real Time PCR-system (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire) , UK), blander TaqMan® Universal PCR Master Mix og de specifikke prober for hvert gen NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) og 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire UK, Cheshire , Storbritannien).

Ifølge Ct opnået fra de to forskellige grupper blev det beregnet de relative udtryksenheder gennem Pfaffl relative kvantificeringsmetode, hvor det blev brugt som kontrol for en rask patient.

Statistisk analyse Den statistiske analyse blev udført gennem Sigmaplot-softwareversion 12.0. Parametrisk og ikke-parametrisk test blev brugt i funktion til variabelfordelingen: blandt de parametriske test, der blev udført for at sammenligne grupperne, blev Elevens T-test inkluderet; de anvendte ikke-parametriske tests var: Mann-Whitney U-testen og Shapiro-Wilk-testen. Endelig blev en modtageroperationskarakteristik (ROC) brugt til analyse af den genetiske ekspression af NF-KB1/IKK epsilon med SPSS-softwareversion 22.0.