NFKB1 e IKK Epsilon en artritis reumatoide (NUIRA)

Los pacientes con diagnóstico confirmado de AR se distribuyeron en dos grupos según el Disease Activity Score 28 (DAS28): a) con actividad clínica yb) con remisión clínica. Los criterios de exclusión clave fueron pacientes con cualquier otra enfermedad inflamatoria o autoinmune y pacientes con infecciones. El grupo control estuvo representado por pacientes sanos Tamaño de la muestra

El cálculo del tamaño de la muestra se realizó a través de la siguiente fórmula:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq Con N=30, Z=2,46 (99 % de confianza), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95 % de precisión). El tamaño de la muestra contenía 20 pacientes con AR.

Medidas antropométricas El peso (kg) y la talla (m) se calcularon en una báscula mecánica de columna (SECA). Los pacientes fueron clasificados según su índice de masa corporal (IMC, peso (Kg)/ talla (m)2) como a) normopeso (IMC< 24,9), b) sobrepeso (24,9 kg/m2 <IMC<29,9 kg/m2) y c) obeso (IMC > 30 kg/m2).

Extracción de linfocitos Los linfocitos de sangre periférica se extrajeron utilizando el kit ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY). Brevemente, una muestra de sangre venosa en tubo EDTA (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ), se centrifugó a 3500 rpm durante 5-8 minutos. La fase intermedia resultante de color blanco se extrajo y se colocó en un tubo eppendorf; Se añadió 1 mL de ACK Lysing Buffer® y se resuspendió cuidadosamente. Nuevamente, la suspensión se centrifugó a 3500 rpm durante 5-8 minutos y se descartó el sobrenadante. Este último paso se repitió hasta que el paquete de leucocitos quedó completamente blanco. Finalmente, se añadieron 100 mcl de ACK Lysing Buffer® y se congelaron a -70ºC para su posterior uso.

Expresión genética A partir del paquete de leucocitos (aproximadamente de 10 a 15 mg), se realizó una extracción de ARN mensajero (ARNm) utilizando el kit de aislamiento de ARN Magna Pure LC III (Roche) en el Instrumento Magna Pure LC 2.0. La relación de absorbancia A260/A280 nm fue >1,8 (calidad) y la concentración de ARN total se calculó determinando la absorbancia a 260 nm establecida con el NanoPhotometer (Implen GmbH, Alemania) y los extractos se ajustaron a una concentración de 20 µg de ADN para la reacción de PCR.

Posteriormente, el ADNc se sintetizó con el Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR), utilizando los cebadores y sondas específicos para NF-KB1, IKK epsilon y 18s (como gen constitutivo), utilizando un sistema 7500 Fast Real Time PCR (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , UK), mezclando TaqMan® Universal PCR Master Mix y las sondas específicas para cada gen NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) y 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , REINO UNIDO).

De acuerdo con el Ct obtenido de los dos grupos diferentes se calcularon las unidades relativas de expresión mediante el método de cuantificación relativa de Pfaffl, en el que se utilizó como control un paciente sano.

Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó a través del software Sigmaplot versión 12.0. Se utilizaron pruebas paramétricas y no paramétricas en función de la distribución de las variables: entre las pruebas paramétricas que se realizaron para comparar los grupos, se incluyó la prueba t de Student; las pruebas no paramétricas aplicadas fueron: La prueba U de Mann-Whitney y la prueba de Shapiro-Wilk. Finalmente, se utilizó una característica operativa del receptor (ROC) para el análisis de la expresión genética de NF-KB1/IKK epsilon con el software SPSS versión 22.0.