NFKB1 a IKK Epsilon u revmatoidní artritidy (NUIRA)

Pacienti s potvrzenou diagnózou RA byli rozděleni do dvou skupin na základě skóre aktivity onemocnění 28 (DAS28): a) s klinickou aktivitou ab) s klinickou remisí. Klíčovými vylučovacími kritérii byli pacienti s jakýmkoli jiným zánětlivým nebo autoimunitním onemocněním a pacienti s infekcemi. Kontrolní skupinu představovali zdraví pacienti Velikost vzorku

Výpočet velikosti vzorku byl proveden podle následujícího vzorce:

n= Nz2 pq /d2(N-1) +z2 pq S N=30, Z=2,46 (99% spolehlivost), p=0,9, q=0,1, d=0,05 (95% přesnost). Velikost vzorku obsahovala 20 pacientů s RA.

Antropometrická měření Hmotnost (kg) a výška (m) byly vypočteny na mechanickém sloupcovém měřítku (SECA). Pacienti byli klasifikováni podle indexu tělesné hmotnosti (BMI, hmotnost (kg)/výška (m)2 jako a) normální hmotnost (BMI< 24,9), b) nadváha (24,9 kg/m2 <BMI<29,9 kg/m2) a c) obézní (BMI> 30 kg/m2).

Extrakce lymfocytů Lymfocyty z periferní krve byly extrahovány pomocí soupravy ACK Lysing Buffer® (Life technologies, Grand Island, NY). Stručně, vzorek žilní krve v EDTA zkumavce (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ) byl centrifugován při 3500 otáčkách za minutu po dobu 5-8 minut. Výsledná přechodná bíle zbarvená fáze byla extrahována a umístěna do Eppendorfovy zkumavky; Byl přidán 1 ml ACK Lysing Buffer® a opatrně resuspendován. Ještě jednou byla suspenze centrifugována při 3500 otáčkách za minutu po dobu 5-8 minut a supernatant byl odstraněn. Tento poslední krok se opakoval, dokud nebyl balíček leukocytů zcela bílý. Nakonec bylo přidáno 100 mcl ACK Lysing Buffer® a zmraženo při -70 °C pro pozdější použití.

Genetická exprese Z balení leukocytů (přibližně 10 až 15 mg) byla provedena extrakce messenger RNA (mRNA) pomocí Magna Pure LC RNA izolačního kitu III (Roche) v Magna Pure LC 2.0 Instrument. Poměr absorbance A260/A280 nm byl >1,8 (kvalita) a celková koncentrace RNA byla vypočtena stanovením absorbance při 260 nm stanovené pomocí NanoPhotometer (Implen GmbH, Německo) a extrakty byly upraveny na koncentraci 20 ug DNA pro PCR reakce.

Následně byla cDNA syntetizována pomocí Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science). Byla provedena polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR) s použitím specifických primerů a sond pro NF-KB1, IKK epsilon a 18s (jako konstitutivní gen), s použitím systému 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , UK), smícháním TaqMan® Universal PCR Master Mix a specifických sond pro každý gen NF-KB1 (Hs00765730-m1), IKK epsilon (Hs01063858-m1) a 18S (Hs99999901-s1), (Applied Biosystems, Applera UK, Cheshire , SPOJENÉ KRÁLOVSTVÍ).

Podle Ct získaného ze dvou různých skupin byly vypočteny relativní jednotky exprese pomocí metody relativní kvantifikace Pfaffl, ve které byl použit jako kontrola zdravého pacienta.

Statistická analýza Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru Sigmaplot verze 12.0. Parametrický a neparametrický test byl použit ve funkci k rozdělení proměnných: mezi parametrický test, který byl proveden pro srovnání skupin, byl zařazen Studentův T-test; použité neparametrické testy byly: Mann-Whitney U test a Shapiro-Wilkův test. Nakonec byla pro analýzu genetické exprese NF-KB1/IKK epsilon se softwarem SPSS verze 22.0 použita provozní charakteristika přijímače (ROC).