青蒿琥酯-阿莫地喹和蒿甲醚-苯蒽对刚果民主共和国南基伍省单纯性疟疾的疗效

3.1 研究设计 符合纳入标准的患有单纯性疟疾的儿童将被纳入（在他们的父母/看护人给予知情同意后），在现场用正在评估的药物治疗并随访 42 天。 药物将在诊所或家中的直接监督下给药。 随访应包括固定的临床和实验室检查时间表。 根据临床和实验室发现，儿童将被归类为治疗失败（早期或晚期）或充分反应者。

在随访期间经历体内治疗失败的病例比例将提供对药物方案疗效的估计。 将进行聚合酶链反应 (PCR) 分析，以区分治疗失败导致的真正复发和再次感染。 该提案符合世卫组织关于在高、中或低传播区进行抗疟疾疗效监测的最新建议11。

3.2 研究地点 研究地点将是刚果民主共和国南基伍省 Baraka 医疗中心 MSF-OCA Baraka 的无国界医生集水区。

3.3 研究人群 研究人群是年龄在 6 至 59 个月之间且患有无并发症的恶性疟原虫疟疾的儿童。 选择这个年龄组是因为它被认为是最脆弱的，并且与年龄较大的儿童和成人相比，自发清除感染的可能性较小。 在高流行地区，他们死于疟疾的风险最高。

3.4 定义 3.4.1 父母/看护人的定义 父母/看护人的定义是年满 18 岁、照顾患者并能提供与患者相关的所有人口统计和健康问题的准确信息并在场的家庭成员调查的时间。

3.5 纳入和排除标准

如果孩子符合以下所有纳入标准，则他/她将有资格参加研究：

• 年龄在 6 至 59 个月之间
• 重量 ≥ 5 公斤
• 载玻片确认仅感染恶性疟原虫（无混合感染）
• 无性寄生虫密度在 2000 到 200000/µl 血液之间
• 测量腋温 ≥ 37.5°C
• 吞咽口服药物的能力
• 尊重后续访问的可能性很高（距离 OPD 步行 1 小时以内的居住地，没有即将到来的旅行计划等）
• 至少 18 岁的父母或看护人的知情同意。

如果孩子符合以下任何排除标准，将被排除在研究参与之外：

• 根据 WHO 定义的一般危险标志（附录 5.1.1）
• 根据 WHO 定义（附录 5.1.2）的严重/复杂疟疾的迹象
• 严重贫血（血红蛋白 < 5 g/dL）
• 已知对任何研究药物过敏史
• 严重急性营养不良（定义为身高别体重低于 -3 Z 分数和/或至少累及足部的对称性水肿）
• 由疟疾以外的原因引起的伴随发热性疾病可能会混淆研究结果（麻疹、急性下呼吸道感染、中耳炎、扁桃体炎、脓肿、严重腹泻伴脱水）。
• 在过去 28 天内（如父母/看护人所示）已经接受了研究中的完整疗程（或其中一种治疗）。 请注意，既往未完全服用正在研究的抗疟疾药物，或未曾服用未研究的抗疟药，均不是排除标准，但应仔细记录任何此类摄入的详细信息。
• 对任何正在测试的药物有超敏反应史或禁忌症。

3.6 样本大小 最近的研究已经确定，使用 Coartem® 疗法 14;17;21;22，儿童因复发（治疗失败）而导致寄生虫血症复发的 42 天风险范围为 0.9-6%。 因此，基于 5% 的寄生虫血症复发风险（由于复发，经 PCR 校正）的保守估计，我们计算出每个治疗组需要 120 名患者来检测无治疗组之间寄生虫血症复发风险的差异。大于 7%（单侧 I 类误差 5%，80% 功率）23。

假设 20% 的样本发生再感染、PCR 结果不确定或失访，则本研究的总估计样本量将为 288 名 6-59 个月的儿童（每组 144 名）。

3.7 评估时间表 第 0 天是通过临床评估、初始疟疾血涂片、首次血红蛋白测量、用于 PCR 的治疗前毛细血管血样、登记和施用所研究药物的第一剂进行筛选的日子。 在第 1 天和第 2 天，治疗将继续进行，儿童将在无国界医生诊所接受重新评估。

儿童将在以下强制性日期返回诊所：第 3、7、14、21、28、35 和 42 天。 在每次预定的访问中，将进行临床检查和血涂片检查。 为鼓励就诊，将提供小额奖励，例如肥皂、毯子和差旅费报销。 所有被招募到该研究中的儿童都会收到经杀虫剂处理过的长效蚊帐。

如果孩子不得不返回诊所进行计划外的访问，每次都将根据需要进行临床和实验室检查。 如果在第 7 天后的任何一天治疗失败，将收集用于 PCR 的毛细血管血样。

3.8 研究终点 研究终点是在疗效研究范围内不再对患者进行随访的时间点。 有效的研究终点包括治疗失败、在没有治疗失败的情况下完成随访期、失访、退出研究（自愿和非自愿）和违反协议11。

3.8.1 早期治疗失败（ETF）

• 在存在寄生虫血症的第 1 天、第 2 天或第 3 天出现危险体征或严重疟疾，或
• 无论腋温如何，第 2 天的寄生虫血症计数高于第 0 天，或
• 第 3 天出现寄生虫血症且腋温 ≥ 37.5°C，或
• 第 3 天的寄生虫血症计数≥第 0 天的 25%，与腋窝温度无关。

3.8.2 晚期临床失败 (LCF)

• 从第 4 天到第 42 天的任何一天，在存在寄生虫血症的情况下出现危险体征或严重疟疾（之前未满足 ETF 的任何标准），或
• 从第 4 天到第 42 天的任何一天存在寄生虫血症和腋温 ≥ 37.5°C（之前未满足 ETF 的任何标准） 3.8.3 晚期寄生虫病 (LPF)
• 从第 7 天到第 42 天的任何一天存在寄生虫血症且腋温 < 37.5°C（之前未满足 ETF 或 LCF 的任何标准） 3.8.4 充分的临床和寄生虫学反应 (ACPR)
• 第 42 天没有寄生虫血症，无论腋窝温度如何（之前未满足 ETF、LCF 或 LPF 的任何标准） 3.8.5 不可分析的终点 如果患者在入组后满足以下任何标准，则其终点不可分析在研究中。 在非劣效性研究中，意向治疗 (ITT) 分析通常会增加错误声称非劣效性（I 类错误）的风险，因此此处不会进行 24。

3.8.5.1 违反协议：

• 未能完成完整的研究治疗方案，除了由于呕吐，
• 患者入组错误（并非所有纳入/排除标准均得到遵守），
• 服用第三方或通过自我用药服用的任何抗疟药或具有抗疟活性的抗生素（复方新诺明、除眼膏外的四环素、多西环素、红霉素、克林霉素、阿奇霉素），
• 患者终点的错误分类（由于实验室或临床错误）导致不合理地实施抢救治疗，
• PCR 结果缺失或未确定的 LCF 或 LPF。 3.8.5.2 提款：
• 入组后第 0 天出现严重疟疾，
• 检测非恶性疟原虫的（混合或单一）感染，
• 多次呕吐任何研究剂量，
• 研究药物的副作用严重到需要停止治疗，
• 因疟疾以外的原因住院，无法进行正常的随访。
• 撤回同意

3.8.6 安全终点 将记录任何不良事件的发生。 将常规询问所有患者以前的症状以及自上次随访以来出现的症状。 当有临床指征时，将对患者进行适当的评估和治疗。 所有严重不良事件都将记录在病例报告表中。

3.9 研究治疗 3.9.1 测试的方案

• 青蒿琥酯-阿莫地喹固定剂量组合，ASAQ FDC（青蒿琥酯-阿莫地喹 Winthrop® Sanofi Aventis）每天 1 片，连续 3 天：

  • 青蒿琥酯 25 毫克/阿莫地喹 67.5 毫克：用于 5 至 8.9 公斤的儿童
  • 青蒿琥酯 50 毫克/阿莫地喹 135 毫克：9 至 17.9 公斤的儿童每天 1 片
  • 青蒿琥酯 100 毫克/阿莫地喹 270 毫克：1 片/天，18 至 34.9 公斤的儿童

• 蒿甲醚 20 毫克 / 苯泛群 120 毫克复合片剂（Coartem®，诺华）在三天内每天两次服用六次：

  • 1 片/剂，适合 5 至 14.9 公斤的儿童（共 6 片）
  • 2 片/剂，适合 15 至 24.9 公斤的儿童（共 12 片）
  • 2 片/剂，体重 15-24.9 公斤 （共 12 个标签）
  • 3 片/剂，体重 25-34.9 Kg（总共 18 片） 第二剂 Coartem® 将在第一剂后 8 小时 (h) 给予，在登记时给予。 在第一次给药后 24 小时、36 小时、48 小时和 60 小时将给予以下剂量。 患者将被给予一杯牛奶或高脂肪食物，或鼓励在每次服药前进行母乳喂养。

正在研究的药物将来自同一批次。 所有研究剂量都将受到监督。 摄入后将直接观察患者 30 分钟。 如果发生呕吐，将重复给药。 如果重复服药也出现呕吐，则该儿童将退出研究，并开始抢救治疗。

为了施用晚间剂量的 Coartem®，家庭访问者/乡村卫生工作者将在第一次剂量后 8 小时、32 小时和 56 小时前往患者家中。 因此，这项研究的招募只会在中午 12 点之前在 OPD 进行 3.9.2 伴随治疗 超过 38°C 的发烧可以用扑热息痛或对乙酰氨基酚治疗，一次剂量为 20 mg/kg 扑热息痛，随后以 15 mg/kg 的剂量间隔 4 至 6 小时进行家庭治疗。 服药前可使用温热的海绵擦拭来退烧。

需要治疗的不良事件可根据当地惯例进行治疗。 如果在研究过程中有任何额外药物的临床指征，包括为治疗与研究药物相关的不良事件而给予的药物，则必须记录药物名称、剂量以及给药日期和时间病例报告表。 除了疟疾以外，在入组或随访期间可能会开具额外的处方，但不会开具具有抗疟疾活性的抗生素（复方新诺明、除眼膏外的四环素、多西环素、红霉素、克林霉素、阿奇霉素），除非没有同样有效的处方备选方案可用。 将仔细记录任何此类处方。

应避免在研究期间使用草药，如果参与者感到不适，应鼓励他们返回研究地点接受治疗。 如果在研究期间服用了任何草药，则应在病例报告表的“研究药物管理”下记录下来。

如有必要，将根据 WHO25 开具止血剂（如硫酸亚铁和叶酸）以改善贫血。

3.9.3 抢救治疗

对于以下病例，应根据 WHO 指南25立即启动疟疾抢救治疗：

• 入组后第 0 天进展为重症疟疾
• 多次呕吐任何研究剂量
• 早期治疗失败
• 晚期临床失败
• 晚期寄生虫学失败
• 在非 P 的随访期间检测。 恶性疟原虫（混合或单一）感染，无论是否发烧 对于接受 ASAQ 作为研究治疗的儿童或接受 Coartem® 作为研究治疗的儿童，救援治疗应包括 6 剂 Coartem® 3 天.
• 在严重疟疾的情况下，救援治疗将在第 0、12 和 24 小时以 2.4 mg/kg 的剂量静脉注射青蒿琥酯，然后每 24 小时一次，直到患者可以接受口服治疗（随后将进行为期 3 天的完整ACT 病程）如果感染间日疟原虫或卵形疟原虫，则应使用氯喹治疗 3 天。

一旦启动救援治疗，对患者的正常研究随访结束，因为已经达到终点。 但是，接受挽救治疗的患者将被要求至少返回研究诊所一次，以便研究团队验证治疗是否有效。

3.10 研究程序 3.10.1 筛选和登记（第 0 天） 所有在 Baraka 健康诊所就诊的 6 至 59 个月的儿童发烧或有发烧史且 RDT 阳性且没有危险体征（附录 5.1.1） 将被送到研究诊所进行筛查。

所有进入筛选过程的患者都将分配一个连续的筛选编号。 筛选表（附录 5.2）将用于记录每个被筛选患者的一般信息和临床观察结果。 将再次评估每位患者的危险体征和严重疟疾的体征。 然后，中上臂围 (MUAC) 将用作营养不良的筛查工具。 将进行初步临床评估，包括纳入和排除标准、既往治疗史（包括摄入任何抗疟疾药物）、临床检查和 MUAC 儿童的身高别体重

将注意检测除疟疾以外的发热性疾病的早期迹象，因为它们的存在将需要排除在研究之外。 这些患者将不会被纳入，但应酌情针对疟疾（如果他们患有寄生虫血症）和其他感染进行治疗。

如果患者符合临床纳入标准，将对他/她进行血液纳入标准检查 (P. 恶性疟原虫单一感染、寄生虫密度和血红蛋白水平）。 厚和薄的疟疾涂片将在同一张载玻片上一式两份，一个涂片将被染色。 同时，毛细管血样将在快速技术分析（核酸）或 FTA 卡上进行 PCR 分析。 患者将等待厚涂片结果。

如果满足所有纳入标准，将邀请患者参加研究。 将向必须年满 18 岁或以上的父母/看护人解释研究目的，并要求获得书面知情同意书（附录 5.4）。 所有家长/看护人都会收到一份包含研究目的和研究团队联系方式的信息表（附录 0）。

如果父母/看护人同意将孩子纳入研究，将为孩子分配一个唯一的患者识别号，并提供带有识别号的腕带。 行政数据（儿童和父母/看护人的姓名、性别、年龄、地址和方向）将记录在个案记录表（附录 5.5）上。 将清楚地解释预约时间表，并分发标有唯一患者识别号的随访卡。

在研究开始之前，每个唯一的患者识别号将被随机分配到一个治疗方案中，并且该信息将包含在密封的信封中。 第一剂研究药物将在健康诊所分发（对于无法吞咽的儿童，将溶解 Coartem® 片剂，并将 ASAQ 片剂在最少量的水中压碎并借助注射器或滴管进行分发）。 摄入量将被观察 30 分钟。 如果孩子呕吐，在尝试重复剂量之前将观察 15 分钟的休息时间。 任何伴随的处方将在指定的药房收集，并将小心确保家长/看护人清楚家庭治疗的说明。

在被送回家之前，如果症状持续或恶化，将反复建议患者的父母/看护人随时将他/她带回研究诊所。

为了施用晚间剂量的 Coartem®，家庭访问者/乡村卫生工作者将在第一次剂量后 8 小时、32 小时和 56 小时前往患者家中。 因此，这项研究的招募只会在中午 12 点之前在 OPD 进行。

3.10.2 随访（第 1 天至第 42 天） 在第 1 天和第 2 天，继续研究药物治疗；第 4 剂（第 1 天）和第 6 剂（第 2 天）复方蒿甲醚剂量将由家庭访问者如上所述在家中给药。 然而，所有患者都将返回无国界医生诊所进行临床评估（包括测量腋窝温度）和通过疟疾玻片进行寄生虫学检查。 在这些门诊就诊期间，将观察所有 ASAQ 以及第 3 次和第 5 次 Coartem® 剂量。

在第 3、7、14、21、28、35 和 42 天，所有患者将返回无国界医生诊所进行临床评估（包括腋温）和血涂片检查。

如果观察到治疗失败（ETF、LCF 或 LPF），将启动救援治疗。 对于第 7 天后发生的 LCF 或 LPF（因为如果再次感染，它不会在第 7 天之前导致临床症状，因此我们可以假设它是复发），将在 FTA 卡上收集第二份血样用于 PCR 分析。

对于计划外的患者就诊，将进行临床评估，如果出现可能的疟疾体征和症状，则可能会采集疟疾玻片（如果治疗失败则采集血样进行 PCR）。

在每次探视后被送回家之前，父母/看护人会被告知随时将病人带回无国界医生诊所，以防生病。 如果在工作时间以外出现紧急情况，建议家长/看护人带上他们的预约卡，并通知急救人员他们的孩子被纳入研究。

将指示急救人员在第二天早上向研究协调员报告有关该事件的所有信息。

家访员将立即尝试追踪未能按计划返回的儿童，以最大程度地减少跟进损失。

未能在第 1 天和第 2 天返回并错过一剂治疗的患者将从研究中退出。 第 3 天后，第 7 天未能返回但在第 6 天或第 8 天（同样第 13/15 天、第 20/22 天、第 27/29 天、第 34/36 天和第 41/43 天）出现的患者可能仍然纳入分析。

3.10.3 测量技术

• 体重将在经过正确校准的吊秤 (Salter) 上测量，精确到 100 克，只让孩子穿着内衣。
• 将在木制身高板上测量身高，如果孩子的身高 > 85 厘米，则让孩子站立，如果他/她的身高 < 85 厘米，则让孩子平躺。
• MUAC 将在左臂肘部和肩部之间的中点处测量，并记录为最接近的毫米。
• 水肿将通过在双脚的背表面施加 3 秒的拇指压力来评估。
• 腋窝温度将使用经过校准的以摄氏度为单位的数字温度计测量，精度为 0.1°C。 如果结果是

3.11 实验室技术 3.11.1 疟疾幻灯片

将在同一张载玻片上制备厚涂片和薄涂片，并在 10% 吉姆萨溶液 (pH 7.2) 中染色 10-15 分钟。 所有涂片必须读至 100 个视野才能被宣布为阴性。 物种将在薄涂片上确认。 将根据 WHO 协议对厚涂片上的恶性疟原虫无性寄生虫血症进行定量 26。 寄生虫将根据至少 200 个白细胞/白细胞 (WBC) 进行计数，并假设正常水平为 8000 WBC/µL，计算寄生虫密度（以每微升血液的寄生虫数表示）：

寄生虫密度(/µL) = 计数的寄生虫数 x 8000 / 计数的 WBC 数 如果在达到 200 WBC 之前计数了 500 只寄生虫，则在该视野结束时停止计数，并使用上述公式计算寄生虫血症。 如果在 200 个 WBC 后计数的寄生虫少于 10 个，则计数将扩展到 500 个白细胞。

是否存在恶性疟原虫配子体不影响终点分类，但会被仔细和系统地记录。 如果涂片含有配子体但不含滋养体（无性寄生虫），则视为阴性。

两名合格的显微镜学家将独立阅读所有载玻片，寄生虫密度将通过对两次计数进行平均来计算。 结果不一致的血涂片（两位显微镜学家在物种诊断上的差异，寄生虫密度 > 50% 或存在寄生虫）将由第三位独立的显微镜学家重新检查，寄生虫密度将通过两者的平均值计算最接近的计数。

数据分析完成后，将销毁所有血涂片。 3.11.2 血红蛋白测量 HemoCue B-血红蛋白分析仪（Ängelholm，瑞典）装置将用于在第 0 天或临床需要的任何其他日期测量血红蛋白。

3.11.3 PCR 基因分型 将进行 PCR 基因分型分析，以区分真正的复发（相同的寄生虫菌株）和新获得的感染（不同的寄生虫菌株）。 如果第 7 天后出现 LCF 或 LPF，将在入组时和随访期间为所有患者收集用于 PCR 的毛细血管血样。

2-3 滴毛细血管血将收集在 FTA 卡上，单独存放在带干燥剂的自封袋中，并远离潮湿、过热和光照。

基因分型将在学术医学中心（荷兰阿姆斯特丹）的医学微生物学系在 Tom van Gool 教授的监督下进行。 将签署材料转让协议。 基因分型程序将基于对恶性疟原虫 MSP-1 和 MSP-2 基因等位基因在预（注册）和治疗后（失败）样本中表达所产生的双基因座基因型的比较27。 具有相似基因型的治疗前和治疗后对将被归类为复发（真正的失败），具有不同基因型的对将被归类为再感染。

3.11.4 疟疾诊断的质量控制在研究开始之前，将建立正确的实验室程序，例如染色技术、染色时间、稀释和数据报告。 将对常规疟疾幻灯片（其中至少 20 张为阳性）进行盲目重读，并审查不一致之处。

设想在研究结束时对在第 0 天和第 42 天之间收集的 20 个阳性载玻片的随机样本进行外部质量控制和参考寄生虫学实验室。

3.11.5 抗疟疾药物耐药性的分子标记 目前还没有明确的分子标记与 ACT 易感性降低相关。 因此，我们目前不期望研究 ACT 耐药性的分子标记。 然而，恶性疟原虫基因组上 13 号染色体的一个区域与响应 ACT 的寄生虫清除率降低有关 28。 如果在未来 5 年内确定了青蒿素耐药性的推定标记，则应将本研究的 FTA 卡提供给全球抗疟耐药网络 (WWARN) 进行分析。 因此，在知情同意书中要求允许在研究结束后将 FTA 卡在荷兰阿姆斯特丹医学中心的 -70⁰C 条件下储存 5 年，并将其用于确定耐药性分子标记。

3.12 数据分析 3.12.1 数据管理 所有病例记录表 (CRF) 将每天使用 EpiData 3.1 软件（丹麦欧登塞）重复输入，合并（验证不一致）并使用 Stata（Stata Corporation，美国）统计软件进行分析. 一旦所有参与者都达到第 3 天并且他们的血涂片结果可用，将对早期治疗失败进行中期分析。 这是为了在早期阶段评估是否应该拒绝关于早期治疗失败的非劣效性假设。 在研究分析结束时，所有 CRF 和其他源数据（同意书、实验室登记表、筛选表等）将安全地存储在首都级别。 数据也将提交给WWARN数据库，用于抗疟疾耐药性的国际监测。 CRF 的副本也将在阿姆斯特丹的 MSF-OCA 保存至少 5 年。 主要研究者负责将所有筛查表、病例报告表和完整的受试者识别代码表保存在安全位置。

3.12.2 分析计划

• 研究描述：筛查的患者数量、恶性疟原虫感染患者的数量、感染其他疟原虫物种的患者数量、排除的患者数量（如果可能，不合格的原因）、纳入的数量、随机化和可分析的患者
• 研究的有效性：内部和外部实验室质量控制的结果，总体不可分析患者的百分比和总体不可分析患者的百分比以及失访率
• 纳入患者的特征：年龄、性别、身高别体重、既往服用抗疟药、腋窝温度、寄生虫密度、配子体携带、血红蛋白。 将进行卡方检验以检验随机化的充分性。
• 研究终点的描述：第 42 天时 ETF、LCF、LPF 和 ACPR 的数量。 将在第 28 天评估类似的结果，以与第 42 天的功效进行比较。
• 不良事件：每种药物在纳入研究的所有患者中不良事件和严重不良事件的比例；
• PCR 基因分型分析：分析的样本数量、复发事件和再感染的数量、混合和未确定结果的数量
• 功效估计：Kaplan-Meier 生存分析方法将在有和没有基因分型调整的情况下使用。 从当天的分析中剔除退出、失访或再次感染的患者。 寄生虫血症复发但 PCR 结果缺失或未确定的患者应在最后一次访视时进行审查，当时发现疟疾涂片呈阴性（因为众所周知患者此时已“治愈”）。
• 数据分析：按方案分析，然后使用 Kaplan-Meier 方法进行生存分析。 除了上面列出的退出原因外，如果 PCR 结果无法分类或 PCR 结果表明失败是由于再次感染间日疟原虫，则患者将被视为退出分析。 P. malariae 或 P. ovale。 每种药物在第 28/42 天的累积成功率和失败率，PCR 未校正和 PCR 校正；以及在第 28/42 天早期治疗失败、晚期临床失败、晚期寄生虫学失败和足够的临床和寄生虫学反应的比例，以及 95% 置信区间，PCR 未校正和 PCR 校正将被计算 3.12.3 研究报告 在研究结束时，主要研究者将提交一份关于研究及其主要结果的报告。 该报告将与国家疟疾控制计划和卫生部共享。

研究结果将在适当的科学会议上发表，并有可能发表在同行评审的期刊上。 数据也将提交给WWARN数据库，用于抗疟疾耐药性的国际监测。

研究结果将与社区领袖分享，并在患者会议上分享。 结果将在健康诊所以通俗语言显示。