Efficacia di artesunato-amodiachina e artemetere-lumefantrina per la malaria non complicata nel Sud Kivu, Repubblica Democratica del Congo

3.1 DISEGNO DELLO STUDIO I bambini con malaria non complicata che soddisfano i criteri di inclusione saranno arruolati (dopo che il genitore/tutore ha dato il consenso informato), trattati in loco con i farmaci in esame e seguiti per un periodo di 42 giorni. I farmaci verranno somministrati sotto diretta supervisione, in clinica oa domicilio. Il follow-up deve consistere in un programma fisso di esami clinici e di laboratorio. Sulla base dei risultati clinici e di laboratorio, i bambini saranno classificati come fallimenti terapeutici (precoci o tardivi) o responsivi adeguati.

La percentuale di casi che hanno sperimentato un fallimento terapeutico in vivo durante il periodo di follow-up fornirà una stima dell'efficacia dei regimi farmacologici. Verrà effettuata un'analisi della reazione a catena della polimerasi (PCR) per differenziare la vera recrudescenza dovuta al fallimento del trattamento da episodi di reinfezione. Questa proposta è conforme alle ultime raccomandazioni dell'OMS per il monitoraggio dell'efficacia antimalarica nelle zone ad alta, media o bassa trasmissione11.

3.2 SITI DI STUDIO Il sito di studio sarà il bacino di MSF dei centri sanitari di Baraka, MSF-OCA Baraka, Sud Kivu, RDC.

3.3 POPOLAZIONE STUDIATA La popolazione studiata è costituita da bambini di età compresa tra 6 e 59 mesi con malaria da P. falciparum non complicata. Questa fascia di età è stata selezionata perché è considerata la più vulnerabile e ha meno probabilità di eliminare le infezioni spontaneamente rispetto ai bambini più grandi e agli adulti. Nelle aree iperendemiche, sono i più a rischio di morire di malaria.

3.4 DEFINIZIONI 3.4.1 DEFINIZIONE DI GENITORE/CUSTODE Il genitore/tutore è definito come il membro della famiglia di età ≥ 18 anni che si prende cura del paziente e può fornire informazioni accurate su tutti i problemi demografici e di salute relativi al paziente ed è presente il momento del sondaggio.

3.5 CRITERI DI INCLUSIONE ED ESCLUSIONE

Un bambino sarà idoneo alla partecipazione allo studio se soddisfa tutti i seguenti criteri di inclusione:

• Età compresa tra 6 e 59 mesi
• Peso ≥ 5Kg
• Solo infezione confermata su vetrino da Plasmodium falciparum (nessuna infezione mista)
• Densità del parassita asessuale tra 2000 e 200000/µl di sangue
• Temperatura ascellare misurata ≥ 37,5°C
• Capacità di deglutire farmaci per via orale
• Elevata probabilità di rispettare le visite di follow-up (residenza entro 1 ora a piedi dall'OPD, nessun programma di viaggio imminente, ecc.)
• Consenso informato di un genitore o tutore di almeno 18 anni.

Un bambino sarà escluso dalla partecipazione allo studio se soddisfa uno dei seguenti criteri di esclusione:

• Segnali di pericolo generici secondo la definizione dell'OMS (allegato 5.1.1)
• Segni di malaria grave/complicata secondo la definizione dell'OMS (Appendice 5.1.2)
• Anemia grave (emoglobina < 5 g/dL)
• Storia nota di ipersensibilità a uno qualsiasi dei farmaci in studio
• Malnutrizione acuta grave (definita da un rapporto peso-altezza inferiore a -3 Z-score e/o edemi simmetrici che coinvolgono almeno i piedi)
• Malattia febbrile concomitante dovuta a cause diverse dalla malaria con il potenziale di confondere l'esito dello studio (morbillo, infezione respiratoria acuta del tratto inferiore, otite media, tonsillite, ascessi, diarrea grave con disidratazione).
• Avere già ricevuto un ciclo completo del trattamento (o uno dei trattamenti) in studio nei 28 giorni precedenti (come indicato dal genitore/tutore). Si noti che la precedente assunzione incompleta di trattamenti antimalarici in fase di studio o la precedente assunzione di antimalarici non in fase di studio non sono criteri di esclusione, ma i dettagli di tale assunzione devono essere registrati con attenzione.
• Storia di reazioni di ipersensibilità o controindicazioni a qualsiasi medicinale in fase di test.

3.6 DIMENSIONE DEL CAMPIONE Studi recenti hanno determinato che il rischio a 42 giorni di parassitemia ricorrente dovuta a recidiva (fallimento del trattamento) nei bambini variava dallo 0,9 al 6% con la terapia con Coartem®14;17;21;22. Pertanto, sulla base di un rischio prudente stimato di parassitemia ricorrente (dovuta a recrudescenza, PCR corretta) del 5%, abbiamo calcolato che sarebbero necessari 120 pazienti per braccio di trattamento per rilevare una differenza nel rischio di parassitemia ricorrente tra i bracci di trattamento di no maggiore del 7% (errore unilaterale di tipo I del 5%, 80% di potenza)23.

Supponendo che nel 20% dei campioni si verifichino reinfezioni, risultati PCR indeterminati o perdita al follow-up, la dimensione totale stimata del campione di questo studio sarà di 288 bambini di età compresa tra 6 e 59 mesi (144 per braccio).

3.7 PROGRAMMA DELLE VALUTAZIONI Il giorno 0 è il giorno dello screening con valutazione clinica, striscio di sangue iniziale della malaria, prima misurazione dell'emoglobina, prelievo di sangue capillare pre-trattamento per PCR, arruolamento e somministrazione della prima dose dei farmaci in studio. Il giorno 1 e il giorno 2, il trattamento continuerà e i bambini saranno rivalutati presso la clinica di MSF.

I bambini torneranno in clinica nei seguenti giorni obbligatori: Giorno 3, 7, 14, 21, 28, 35 e 42. Ad ogni visita programmata verrà eseguito un esame clinico e uno striscio di sangue. Per incoraggiare la frequenza in clinica, saranno offerti piccoli incentivi come sapone, coperte e rimborsi di viaggio. Tutti i bambini reclutati nello studio ricevono una rete da letto trattata con insetticida a lunga durata.

Se i bambini devono tornare in clinica per visite non programmate, in ogni momento verranno eseguiti gli esami clinici e di laboratorio secondo necessità. In caso di fallimento del trattamento in qualsiasi giorno dopo il giorno 7, verrà raccolto un campione di sangue capillare per PCR.

3.8 PUNTI FINE DELLO STUDIO Un punto finale dello studio è il punto in cui un paziente non sarà più seguito nel contesto dello studio di efficacia. Gli endpoint validi dello studio includono il fallimento del trattamento, il completamento del periodo di follow-up senza fallimento del trattamento, la perdita al follow-up, il ritiro dallo studio (volontario e involontario) e la violazione del protocollo11.

3.8.1 FALLIMENTO DEL TRATTAMENTO PRECOCE (ETF)

• Sviluppo di segni di pericolo o malaria grave al Giorno 1, Giorno 2 o Giorno 3 in presenza di parassitemia, o
• Parassitemia al giorno 2 superiore al conteggio del giorno 0 indipendentemente dalla temperatura ascellare, o
• Parassitemia al Giorno 3 con temperatura ascellare ≥ 37,5°C, o
• Parassitemia al giorno 3 ≥ 25% del conteggio del giorno 0 indipendentemente dalla temperatura ascellare.

3.8.2 FALLIMENTO CLINICO TARDIVO (LCF)

• Sviluppo di segnali di pericolo o malaria grave in qualsiasi giorno dal Giorno 4 al Giorno 42 in presenza di parassitemia (senza aver precedentemente soddisfatto nessuno dei criteri dell'ETF), o
• Presenza di parassitemia e temperatura ascellare ≥ 37,5°C in qualsiasi giorno dal Giorno 4 al Giorno 42 (senza aver precedentemente soddisfatto nessuno dei criteri dell'ETF) 3.8.3 FALLIMENTO PARASSITOLOGICO TARDIVO (LPF)
• Presenza di parassitemia e temperatura ascellare < 37,5°C in qualsiasi giorno dal giorno 7 al giorno 42 (senza aver precedentemente soddisfatto nessuno dei criteri di ETF o LCF) 3.8.4 RISPOSTA CLINICA E PARASSITOLOGICA ADEGUATA (ACPR)
• Assenza di parassitemia al giorno 42 indipendentemente dalla temperatura ascellare (senza aver precedentemente soddisfatto nessuno dei criteri di ETF, LCF o LPF) 3.8.5 ENDPOINT NON ANALIZZABILI L'endpoint di un paziente non è analizzabile se soddisfa uno dei seguenti criteri dopo la sua arruolamento nello studio. Negli studi di non inferiorità, l'analisi Intention-to-treat (ITT) spesso aumenta il rischio di affermare erroneamente la non inferiorità (errore di tipo I), quindi non verrà eseguita qui24.

3.8.5.1 Violazione del protocollo:

• Mancato completamento dell'intero regime di trattamento in studio, diverso da quello dovuto a vomito,
• Arruolamento errato del paziente (non tutti i criteri di inclusione/esclusione rispettati),
• Assunzione di qualsiasi antimalarico o antibiotico con attività antimalarica (cotrimoxazolo, tetraciclina ad eccezione di unguento per gli occhi, doxiciclina, eritromicina, clindamicina, azitromicina) somministrato da terzi o attraverso l'automedicazione,
• Errata classificazione dell'endpoint del paziente (a causa di un errore di laboratorio o clinico) che porta alla somministrazione ingiustificata del trattamento di salvataggio,
• LCF o LPF con risultato PCR mancante o indeterminato. 3.8.5.2 Recesso:
• Malaria grave che si verifica il giorno 0 dopo l'arruolamento,
• Rilevamento di un'infezione (mista o mono) con una specie non falciparum,
• Vomitare qualsiasi dose dello studio più di una volta,
• Effetti collaterali del farmaco in studio abbastanza gravi da richiedere l'interruzione del trattamento,
• Ricovero per un motivo diverso dalla malaria, rendendo impossibili le normali visite di follow-up.
• Revoca del consenso

3.8.6 ENDPOINT DI SICUREZZA Il verificarsi di qualsiasi evento avverso sarà documentato. A tutti i pazienti verrà chiesto di routine sui sintomi precedenti e sui sintomi emersi dalla precedente visita di follow-up. Quando clinicamente indicato, i pazienti saranno valutati e trattati in modo appropriato. Tutti gli eventi avversi gravi saranno registrati sul modulo di segnalazione del caso.

3.9 TRATTAMENTI IN STUDIO 3.9.1 REGIMI TESTATI

• Combinazione a dose fissa di artesunato-amodiachina, ASAQ FDC (artesunato-amodiachina Winthrop® Sanofi Aventis) somministrata come 1 compressa al giorno per 3 giorni:

  • Artesunato 25 mg / amodiachina 67,5 mg: nei bambini da 5 a 8,9 kg
  • Artesunato 50 mg / amodiachina 135 mg: 1 compressa/die nei bambini da 9 a 17,9 kg
  • Artesunato 100 mg / amodiachina 270 mg: 1 compressa/die nei bambini da 18 a 34,9 kg

• Artemetere 20 mg / lumefantrina 120 mg compresse co-formulate (Coartem®, Novartis) somministrate in sei dosi due volte al giorno per tre giorni:

  • 1 compressa/dose per bambini da 5 a 14,9 kg (totale 6 compresse)
  • 2 compresse/dose per bambini da 15 a 24,9 kg (totale 12 compresse)
  • 2 compresse/dose per peso 15-24,9 kg (totale 12 schede)
  • 3 compresse/dose per peso 25-34,9 Kg (totale 18 compresse) La seconda dose di Coartem® verrà somministrata 8 ore (h) dopo la prima dose, somministrata al momento dell'arruolamento. Le seguenti dosi verranno somministrate 24 ore, 36 ore, 48 ore e 60 ore dopo la prima dose. Ai pazienti verrà somministrato un bicchiere di latte o cibi grassi o incoraggiati ad allattare prima di assumere ogni dose.

I farmaci oggetto di studio proverranno dallo stesso lotto. Tutte le dosi dello studio saranno supervisionate. I pazienti saranno osservati direttamente dopo l'assunzione per 30 minuti. In caso di vomito, verrà somministrata una dose ripetuta. Se anche la dose ripetuta vomita, il bambino verrà ritirato dallo studio e verrà avviato il trattamento di salvataggio.

Per somministrare le dosi serali di Coartem®, un visitatore domiciliare/operatore sanitario del villaggio si recherà a casa del paziente 8h, 32h e 56h dopo la prima dose. Pertanto, il reclutamento per questo studio avverrà solo nell'OPD prima delle 12:00. 3.9.2 TRATTAMENTO CONCOMITANTE La febbre superiore a 38°C può essere trattata con paracetamolo o paracetamolo, una dose di 20 mg/kg di paracetamolo, seguita da 15 mg/kg a intervalli di 4-6 ore per il trattamento domiciliare. Le spugnature tiepide possono essere utilizzate per ridurre la febbre prima dell'assunzione del farmaco.

Gli eventi avversi che richiedono un trattamento possono essere trattati secondo la pratica locale. Se esiste un'indicazione clinica per qualsiasi farmaco aggiuntivo durante il corso dello studio, compresi i farmaci somministrati per trattare un evento avverso correlato al medicinale in studio, il nome del medicinale, il dosaggio e la data e l'ora della somministrazione devono essere registrati sul il modulo di segnalazione del caso. Ulteriori prescrizioni possono essere fornite all'arruolamento o durante il follow-up per condizioni diverse dalla malaria, sebbene gli antibiotici con attività antimalarica (cotrimossazolo, tetraciclina ad eccezione di unguento per gli occhi, doxiciclina, eritromicina, clindamicina, azitromicina) non saranno prescritti a meno che non siano ugualmente efficaci sono disponibili alternative. Eventuali prescrizioni di questo tipo saranno annotate attentamente.

L'uso di rimedi erboristici durante lo studio dovrebbe essere evitato e i partecipanti dovrebbero essere incoraggiati a tornare nel sito dello studio per il trattamento se non si sentono bene. Se durante lo studio vengono assunti rimedi erboristici, ciò deve essere registrato nel modulo di segnalazione del caso, alla voce "somministrazione del farmaco in studio".

Gli ematinici (come il solfato ferroso e l'acido folico) saranno prescritti per migliorare l'anemia secondo l'OMS25, se necessario.

3.9.3 TRATTAMENTO DI SALVATAGGIO

Il trattamento di salvataggio per la malaria deve essere avviato immediatamente secondo le linee guida dell'OMS25 per i seguenti casi:

• Progressione alla malaria grave il giorno 0 dopo l'arruolamento
• Vomitare qualsiasi dose dello studio più di una volta
• Fallimento precoce del trattamento
• Fallimento clinico tardivo
• Fallimento parassitologico tardivo
• Rilevamento durante il follow-up di un non-P. falciparum (mista o mono-), indipendentemente dalla febbre Il trattamento di salvataggio consisterà in Coartem® a sei dosi per 3 giorni per i bambini che avevano ricevuto ASAQ come trattamento in studio o ASAQ per i bambini che avevano ricevuto Coartem® come trattamento in studio .
• In caso di malaria grave, il trattamento di salvataggio sarà artesunato per via endovenosa alla dose di 2,4 mg/kg alle ore 0, 12 e 24, quindi una volta ogni 24 ore fino a quando il paziente non potrà assumere la terapia orale (questa sarà seguita da 3 giorni completi corso di ACT) Le specie non falciparum rilevate durante il follow-up devono essere trattate con clorochina per 3 giorni in caso di infezione da P. vivax o P. ovale.

Una volta avviato il trattamento di salvataggio, il normale follow-up dello studio termina per il paziente, poiché è stato raggiunto un endpoint. Tuttavia, ai pazienti che ricevono un trattamento di salvataggio verrà chiesto di tornare alla clinica dello studio almeno una volta, in modo che il team dello studio possa verificare se il trattamento è stato efficace.

3.10 PROCEDURA DELLO STUDIO 3.10.1 SCREENING E ISCRIZIONE (GIORNO 0) Tutti i bambini di età compresa tra 6 e 59 mesi che si presentano presso la clinica Baraka Health con febbre o storia di febbre e RDT positivo e senza segni di pericolo (Appendice 5.1.1) verrà inviato alla clinica dello studio per lo screening.

A tutti i pazienti che accedono al processo di screening verrà assegnato un numero di screening consecutivo. Il modulo di screening (Appendice 5.2) verrà utilizzato per registrare le informazioni generali e le osservazioni cliniche di ciascun paziente sottoposto a screening. Ogni paziente verrà nuovamente valutato per segni di pericolo e segni di malaria grave. La circonferenza medio-superiore del braccio (MUAC) verrà quindi utilizzata come strumento di screening per la malnutrizione. Verrà effettuata una valutazione clinica iniziale che includa i criteri di inclusione ed esclusione, la storia del trattamento precedente (inclusa l'ingestione di eventuali farmaci antimalarici), l'esame clinico e il peso per altezza sui bambini con MUAC

Sarà prestata attenzione per rilevare i primi segni di malattie febbrili diverse dalla malaria, poiché la loro presenza richiederà l'esclusione dallo studio. Questi pazienti non saranno arruolati ma dovrebbero essere trattati sia per la malaria (se hanno parassitemia) sia per l'altra infezione, a seconda dei casi.

Se il paziente soddisfa i criteri di inclusione clinica, sarà esaminato per i criteri di inclusione ematica (P. monoinfezione da Falciparum, densità del parassita e livelli di emoglobina). Strisci di malaria spessi e sottili verranno prelevati sullo stesso vetrino in duplicato e uno striscio verrà colorato. Contemporaneamente verrà prelevato un campione di sangue capillare su Fast Technology for Analysis (degli acidi nucleici) o FTA Card per analisi PCR. Il paziente attenderà il risultato dello striscio spesso.

Se tutti i criteri di inclusione sono soddisfatti, il paziente sarà invitato a iscriversi allo studio. Lo scopo dello studio sarà spiegato al genitore/tutore che deve avere almeno 18 anni e sarà richiesto un consenso informato scritto (Appendice 5.4). Tutti i genitori/tutori riceveranno un foglio informativo contenente lo scopo dello studio e i recapiti del gruppo di studio (Appendice 0).

Se il genitore/tutore acconsente a includere il bambino nello studio, al bambino verrà assegnato un numero di identificazione univoco del paziente e verrà fornito un braccialetto con il numero di identificazione. I dati amministrativi saranno registrati (nome del bambino e del genitore/tutore, sesso, età, indirizzo e indirizzo) su un modulo di registrazione dei casi (Appendice 5.5). Verrà chiaramente spiegato un programma degli appuntamenti e verrà consegnata una scheda di follow-up contrassegnata con il numero di identificazione univoco del paziente.

Ogni numero di identificazione univoco del paziente verrà assegnato in modo casuale a un regime di trattamento prima dell'inizio dello studio e queste informazioni saranno contenute in buste sigillate. La prima dose del farmaco in studio verrà dispensata presso la clinica sanitaria (per i bambini che non possono deglutire, le compresse di Coartem® verranno sciolte e le compresse di ASAQ verranno frantumate in quantità minime di acqua e dispensate con l'aiuto di una siringa o contagocce). L'assunzione sarà osservata per 30 minuti. Se il bambino vomita, verrà osservato un periodo di riposo di 15 minuti prima di tentare una dose ripetuta. Eventuali prescrizioni concomitanti saranno raccolte presso la farmacia designata e sarà prestata attenzione per garantire che le istruzioni sul trattamento domiciliare siano chiare al genitore/tutore.

Prima di essere rimandato a casa, al genitore/tutore del paziente verrà ripetutamente consigliato di riportarlo alla clinica dello studio in qualsiasi momento se i sintomi persistono o peggiorano.

Per somministrare le dosi serali di Coartem®, un visitatore domiciliare/operatore sanitario del villaggio si recherà a casa del paziente 8h, 32h e 56h dopo la prima dose. Pertanto, il reclutamento per questo studio avverrà solo nell'OPD prima delle 12:00.

3.10.2 FOLLOW-UP (DAL GIORNO 1 AL GIORNO42) Nei giorni 1 e 2, il trattamento con il farmaco oggetto dello studio viene continuato; la quarta (Giorno 1) e la sesta (Giorno 2) dosi di Coartem® saranno somministrate a casa come descritto sopra da un visitatore domiciliare. Tuttavia, tutti i pazienti torneranno alla clinica di MSF per una valutazione clinica (inclusa la misurazione della temperatura ascellare) e un esame parassitologico mediante vetrino della malaria. Durante queste visite cliniche verranno osservate tutte le dosi di ASAQ e la 3a e 5a dose di Coartem®.

Nei giorni 3, 7, 14, 21, 28, 35 e 42, tutti i pazienti torneranno alla clinica di MSF per una valutazione clinica (compresa la temperatura ascellare) e l'esame dello striscio di sangue.

Se si osserva un fallimento del trattamento (ETF, LCF o LPF) verrà avviato il trattamento di salvataggio. Per LCF o LPF che si verificano dopo il giorno 7 (poiché se c'è una reinfezione non porterà a sintomi clinici prima del giorno 7, quindi possiamo presumere che si tratti di una recrudescenza) verrà raccolto un secondo campione di sangue su schede FTA per l'analisi PCR.

Per le visite non programmate dei pazienti, verrà eseguita una valutazione clinica e potrebbe essere prelevato un vetrino per la malaria (e un campione di sangue per la PCR in caso di fallimento del trattamento) se vi sono segni e sintomi di possibile malaria.

Prima di essere rimandato a casa dopo ogni visita, al genitore/tutore verrà consigliato di riportare il paziente alla clinica di MSF in qualsiasi momento in caso di malattia. In caso di emergenza al di fuori dell'orario di lavoro, i genitori/tutori saranno invitati a portare con sé la scheda dell'appuntamento e ad informare il personale di emergenza dell'inclusione del proprio figlio nello studio.

Saranno date istruzioni al personale di emergenza per riferire tutte le informazioni relative all'evento al coordinatore dello studio la mattina successiva.

I tentativi di rintracciare i bambini che non tornano per le visite programmate saranno effettuati immediatamente da un visitatore domiciliare per ridurre al minimo le perdite al follow-up.

I pazienti che non tornano nei giorni 1 e 2 e saltano una dose del trattamento verranno ritirati dallo studio. Dopo il giorno 3, i pazienti che non tornano il giorno 7 ma sono presenti il ​​giorno 6 o 8 (così come i giorni 13/15, i giorni 20/22, i giorni 27/29, i giorni 34/36 e i giorni 41/43) possono ancora essere inclusi nell'analisi.

3.10.3 TECNICHE DI MISURA

• Il peso sarà misurato con l'approssimazione di 100 g su una bilancia appesa (Salter) opportunamente calibrata con solo indumenti intimi tenuti sul bambino.
• L'altezza verrà misurata su una tavola di legno, chiedendo al bambino di stare in piedi se è > 85 cm, o distendendolo orizzontalmente se è < 85 cm.
• MUAC sarà misurato sul braccio sinistro, nel punto medio tra il gomito e la spalla e sarà registrato al mm più vicino.
• L'edema sarà valutato mediante una pressione del pollice di 3 secondi sulla superficie dorsale di entrambi i piedi.
• La temperatura ascellare sarà misurata con un termometro digitale calibrato graduato in Celsius, con una precisione di 0,1°C. Se il risultato è

3.11 TECNICHE DI LABORATORIO 3.11.1 VETRINI MALARIA

Strisci spessi e sottili saranno preparati sullo stesso vetrino e colorati in soluzione Giemsa al 10% (pH 7.2) per 10-15 minuti. Tutti gli smear devono essere letti fino a 100 campi prima di poter essere dichiarati negativi. Le specie saranno confermate sullo striscio sottile. La quantificazione della parassitemia asessuale da P. falciparum sullo striscio spesso sarà eseguita secondo il protocollo dell'OMS26. I parassiti saranno contati rispetto ad almeno 200 globuli bianchi/leucociti (WBC) e la densità del parassita (espressa in parassiti per µL di sangue) sarà calcolata assumendo un livello normale di 8000 WBC/µL:

Densità del parassita (/µL) = numero di parassiti contati x 8000 / numero di globuli bianchi contati Se vengono contati 500 parassiti prima di raggiungere 200 globuli bianchi, il conteggio verrà interrotto alla fine di quel campo e la parassitemia verrà calcolata con la formula precedente. Se vengono contati meno di 10 parassiti dopo 200 globuli bianchi, il conteggio verrà esteso a 500 globuli bianchi.

La presenza o l'assenza di gametociti di P. falciparum non influenza la classificazione dell'endpoint, ma sarà registrata con attenzione e sistematicamente. Se uno striscio contiene gametociti ma non trofozoiti (parassiti asessuati) sarà considerato negativo.

Due microscopisti qualificati leggeranno tutti i vetrini in modo indipendente e le densità dei parassiti saranno calcolate facendo la media dei due conteggi. Strisci di sangue con risultati discordanti (differenze tra i due microscopisti nella diagnosi di specie, nella densità del parassita >50% o in presenza di parassiti) saranno riesaminate da un terzo microscopista indipendente e la densità del parassita sarà calcolata facendo la media dei due conteggi più vicini.

Tutti gli strisci di sangue verranno distrutti una volta completata l'analisi dei dati. 3.11.2 MISURAZIONE DELL'EMOGLOBINA L'apparecchio per l'analisi dell'emoglobina HemoCue B (Ängelholm, Svezia) verrà utilizzato per misurare l'emoglobina il giorno 0 o qualsiasi altro giorno se clinicamente giustificato.

3.11.3 GENOTIPIZZAZIONE PCR L'analisi di genotipizzazione PCR sarà eseguita per distinguere la vera recrudescenza (stesso ceppo parassitario) da un'infezione di nuova acquisizione (diverso ceppo parassitario). Saranno raccolti campioni di sangue capillare per PCR per tutti i pazienti al momento dell'arruolamento e durante il follow-up in caso di LCF o LPF dopo il giorno 7.

2-3 gocce di sangue capillare verranno raccolte su carte FTA, conservate singolarmente in buste con chiusura a zip con essiccante e tenute al riparo da umidità, calore eccessivo e luce.

La genotipizzazione sarà eseguita presso il dipartimento di microbiologia medica, presso l'Academic Medical Center (Amsterdam, Paesi Bassi), sotto la supervisione del Prof. Dott. Tom van Gool. Verrà firmato un accordo di trasferimento materiale. La procedura di genotipizzazione sarà basata sul confronto del genotipo a due loci risultante dall'espressione degli alleli genici MSP-1 e MSP-2 di P. falciparum in campioni pre- (arruolamento) e post-trattamento (fallimento)27. Le coppie pre e post-trattamento con genotipo simile saranno classificate come recrudescenza (vero fallimento) e le coppie con genotipo diverso saranno classificate come re-infezione.

3.11.4 CONTROLLO DI QUALITÀ DELLA DIAGNOSI DELLA MALARIA Prima dell'inizio dello studio, verranno stabilite le corrette procedure di laboratorio, come la tecnica di colorazione, il tempo di colorazione, la diluizione e la segnalazione dei dati. Verrà eseguita una rilettura in cieco dei vetrini di routine sulla malaria (di cui almeno 20 saranno positivi) e verranno esaminate le discordanze.

Al termine dello studio è previsto un controllo di qualità esterno, con laboratorio parassitologico di riferimento, su un campione casuale di 20 vetrini positivi raccolti tra il Giorno 0 e il Giorno 42.

3.11.5 MARCATORI MOLECOLARI PER LA RESISTENZA AI FARMACI ANTI-MALARIA Attualmente non ci sono chiari marcatori molecolari associati alla ridotta suscettibilità agli ACT. Pertanto non prevediamo in questo momento di studiare i marcatori molecolari della resistenza all'ACT. Tuttavia, è stata identificata una regione del cromosoma 13 sul genoma di P. falciparum che è collegata alla diminuzione dei tassi di eliminazione del parassita in risposta agli ACT28. Se nei prossimi 5 anni vengono identificati marcatori putativi di resistenza all'artemisinina, le carte FTA di questo studio dovrebbero essere messe a disposizione del World Wide Antimalarial Resistance Network (WWARN) per l'analisi. Nei moduli di consenso informato sarà pertanto richiesta l'autorizzazione a conservare le schede FTA a -70⁰C presso l'Amsterdam Medical Centre, Paesi Bassi per 5 anni dopo la conclusione dello studio, e il loro utilizzo per la determinazione dei marcatori molecolari di resistenza.

3.12 ANALISI DEI DATI 3.12.1 GESTIONE DEI DATI Tutti i moduli di registrazione dei casi (CRF) verranno inseriti giornalmente due volte utilizzando il software EpiData 3.1 (Odense, Danimarca), uniti (con verifica delle incongruenze) e analizzati utilizzando il software statistico Stata (Stata Corporation, USA) . Un'analisi ad interim del fallimento precoce del trattamento verrà effettuata una volta che tutti i partecipanti avranno raggiunto il giorno 3 e saranno disponibili i risultati dello striscio di sangue. Questo per valutare in una fase iniziale se l'ipotesi di non inferiorità relativa al fallimento precoce del trattamento debba essere respinta. Al termine dell'analisi dello studio, tutti i CRF e altri dati di origine (moduli di consenso, registri di laboratorio, moduli di screening, ecc.) verranno archiviati in modo sicuro a livello di capitale. I dati saranno inoltre inviati al database WWARN per il monitoraggio internazionale della resistenza ai farmaci antimalarici. Una copia delle CRF sarà inoltre conservata per almeno 5 anni presso MSF-OCA ad Amsterdam. Il ricercatore principale è responsabile della conservazione di tutti i moduli di screening, del modulo di segnalazione del caso e dell'elenco completo dei codici di identificazione del soggetto in un luogo sicuro.

3.12.2 PIANO DI ANALISI

• Descrizione dello studio: numero di pazienti sottoposti a screening, numero di pazienti con infezione da P. falciparum, numero di pazienti infetti da altre specie di Plasmodium, numero di pazienti esclusi (e, se possibile, motivi di non ammissibilità), numero di inclusi, pazienti randomizzati e analizzabili
• Validità dello studio: risultati sul controllo di qualità del laboratorio interno ed esterno, % di pazienti complessivi non analizzabili e % di pazienti complessivi non analizzabili e % di perdita al follow-up
• Caratteristiche dei pazienti inclusi: età, sesso, peso per altezza, precedente assunzione di antimalarici, temperatura ascellare, densità del parassita, trasporto di gametociti, emoglobina. Verrà eseguito il test del chi-quadrato per testare l'adeguatezza della randomizzazione.
• Descrizione degli endpoint dello studio: numero di ETF, LCF, LPF e ACPR al giorno 42. Risultati simili sarebbero stati valutati al giorno 28 per il confronto con l'efficacia al giorno 42.
• Eventi avversi: la percentuale di eventi avversi e di eventi avversi gravi in ​​tutti i pazienti inclusi nello studio per ciascun farmaco;
• Analisi di genotipizzazione PCR: numero di campioni analizzati, numero di episodi di recrudescenza e reinfezioni, numero di risultati misti e indeterminati
• Stime di efficacia: i metodi di analisi della sopravvivenza Kaplan-Meier saranno utilizzati con e senza aggiustamento della genotipizzazione. I pazienti ritirati, persi al follow-up o con reinfezioni vengono censurati dall'analisi in quel giorno. I pazienti con una recidiva di parassitemia, ma con risultati PCR mancanti o indeterminati devono essere censurati durante l'ultima visita quando lo striscio della malaria è risultato negativo (poiché è noto che il paziente era "guarito" a quel punto).
• Analisi dei dati: analisi per protocollo seguita da un'analisi di sopravvivenza utilizzando il metodo Kaplan-Meier. Oltre ai motivi di ritiro sopra elencati, i pazienti saranno considerati ritirati dall'analisi se i risultati della PCR non sono classificabili o se i risultati della PCR indicano che il fallimento è dovuto alla reinfezione da P. vivax. P. malariae o P. ovale. L'incidenza cumulativa dei tassi di successo e fallimento al giorno 28/42, PCR non corretta e PCR corretta per ciascun farmaco; e verrà calcolata la proporzione di fallimento precoce del trattamento, fallimento clinico tardivo, fallimento parassitologico tardivo e risposta clinica e parassitologica adeguata al giorno 28/42, con intervalli di confidenza al 95%, PCR non corretta e PCR corretta 3.12.3 RAPPORTO DELLO STUDIO Al termine dello studio, il ricercatore principale presenterà un rapporto sullo studio e sui suoi risultati principali. Questo rapporto sarà condiviso con il programma nazionale di controllo della malaria e il Ministero della Salute.

I risultati dello studio saranno presentati a riunioni scientifiche appropriate e potenzialmente pubblicati in una rivista peer-reviewed. I dati saranno inoltre inviati al database WWARN per il monitoraggio internazionale della resistenza ai farmaci antimalarici.

I risultati dello studio saranno condivisi con i leader della comunità e nelle riunioni dei pazienti. I risultati saranno visualizzati in lingua laica nella clinica sanitaria.