Dribbles抗原靶向激活T细胞治疗晚期肺癌

恶性肿瘤已成为人类死亡的首要原因，而恶性肿瘤中的头号杀手是肺癌。 环境污染加剧，肺癌发病率上升，死亡率居高不下，最糟糕的是5年生存率仅为15%左右，在恶性肿瘤中居首位，新型抗肿瘤技术和产品的开发迫在眉睫传统的三种治疗方法（手术、放疗、化疗）未能有效遏制肿瘤对人们生命健康的威胁，越来越受到政府和企业的重视。 生物免疫疗法被《科学》杂志评选为2013年十大突破之一，被认为是21世纪癌症治疗的新发展方向。

现有的免疫治疗主要包括：过继免疫治疗、肿瘤疫苗治疗、免疫检查点-抗体治疗及其他辅助治疗，而过继免疫治疗是这些治疗中最先研究和开发的，也是最成熟的治疗方法。 许多单位开展的过继免疫治疗主要是自体DC-CIK免疫治疗，即树突状细胞（Dendritic cells，DC）和细胞因子诱导杀伤细胞（Cytokine Induced Killer，CIK）免疫治疗。 该技术的原理是：将人外周血的单核细胞和淋巴细胞分离出来，然后在体外通过多种细胞因子（如IFN-γ、IL-1、IL-2、抗-CD3 mAb）增强激活成具有抗原呈递和广谱杀伤肿瘤细胞功能的混合淋巴细胞。 将活化的DC-CIK扩增后静脉回输给患者，与体内肿瘤细胞结合后释放CIK细胞穿孔素、谷酶B等活性物质至肿瘤细胞，溶解肿瘤细胞。同时分泌多种IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，提高机体的免疫功能，并赋予抗肿瘤功能的作用。

现有文献报道和我们前期在生物治疗中心的研究表明，对绝大多数患者来说安全性好、副作用小、耐受性好。 在疗效方面，目前的报道显示DC-CIK技术对除肺癌外的白血病、淋巴瘤、卵巢癌、胃癌等均有很好的疗效。肿瘤特异性 T 细胞反应。 如何提高肺癌抗原呈递的有效性，激发更强的肿瘤特异性T细胞反应，是提高肺癌免疫治疗疗效的需要解决的问题。

近年检查点抗体疗法在肿瘤免疫治疗方面有所突破，包括CTLA-4、PD-1和PD-L1。多项临床研究表明，PD-1和PD-L1抗体治疗晚期NSCLC，尤其是肺鳞癌具有良好的治疗效果，疾病客观缓解率达到10-23%。 自体DC/CIK治疗在国内已广泛开展，并被许多临床实践证明具有良好的安全性。由于缺乏有效的肿瘤抗原，目前尚无大型随机、双盲研究证实其在延长患者生存期和治疗中的作用。到目前为止阻止肿瘤进展。 一些医院采用了肿瘤细胞裂解液或单分子蛋白肽/DC联合CIK技术，即将肿瘤细胞裂解液或单分子蛋白肽作为肿瘤抗原加载到DC上，同时与体外诱导CIK联合。相对于单独的CIK疗法，该单元疗法不仅可以对肿瘤进行非特异性损伤，还可以诱导机体产生肿瘤特异性免疫反应。但肿瘤细胞裂解物中所含的肿瘤抗原多为长寿蛋白，不能被人体有效摄取。 DC，导致DC呈递给T淋巴细胞的有效抗原有限。 此外，肿瘤抗原长寿蛋白可长期存在于自然生长的肿瘤细胞中，其自身组织可被患者识别，因此免疫耐受抑制了影响杀伤肿瘤效果的免疫反应。 单分子蛋白多肽只诱导对单一或少数肿瘤抗原的特异性免疫反应，不会对突变的肿瘤抗原产生特异性免疫反应，从而导致肿瘤逃逸。 由于自体DC/CIK疗法不能产生有效的免疫反应，我们需要开发新的细胞疗法，为未来联合检查点抗体疗法提供新的备选方案。

近日，胡红明博士团队提出了一种创新的癌症治疗策略：利用细胞自噬作用捕获肿瘤抗原，制备肿瘤疫苗。 在该策略中，用硼替佐米（蛋白酶体抑制剂）处理的体外培养肿瘤细胞的蛋白酶体活性阻断导致自噬体中短寿命蛋白（SLiPs）和错误折叠蛋白（DRiPs）的富集，称为DRibbles小体。 由收集这些DRibbles小体制剂制成的肿瘤疫苗，也称为DRibble疫苗。我们早期的研究表明，DRibble肿瘤疫苗比肿瘤细胞疫苗更有效，因为整个肿瘤细胞疫苗不含易降解的短-不能有效交叉呈递给 DC 的活蛋白。 这些短寿命蛋白避免被DRibble疫苗中的蛋白酶体降解，并被包装到具有双层膜结构的自噬体囊泡中。 这些囊泡含有内源性风险信号分子（如HSP90、HMGB1等），可有效触发先天性免疫反应。 因此，当与一次DRibble疫苗共培养时，DC可有效摄取DRibble疫苗并将肿瘤相关抗原呈递到DC表面，与MHC分子结合激活T细胞，从而产生免疫反应。 与全肺癌疫苗相比，DRibble肺癌疫苗可提供更广泛的肿瘤相关抗原，使机体不再保持对缺乏交叉呈递的耐受性，从而引起强烈的免疫反应。 胡宏明博士团队还发现，与自体肿瘤细胞DRibble疫苗相比，同种异体Dribble可诱导同样有效的免疫反应和肿瘤消退，该结果已在多种肿瘤模型中得到证实。 由于缺乏经典的MHC分子，DRibble疫苗蛋白可被DC快速降解，同种异体DRibble疫苗不会因诱导同种异体移植物免疫反应而产生不良反应，保持其安全性和有效性。

DRibble表面有大量DC靶分子配体，直接与表面高表达CLEC9A的xDC细胞结合。 xDC细胞可以高效地将抗原交叉呈递给DC，从而可以提高DRibble抗原的呈递效率。 此外，DRibble诱导的免疫反应具有免疫记忆，能识别多种肿瘤特异性抗原，在再次受到刺激时，会放大对抗肿瘤细胞再生的作用，防止肿瘤逃逸。美国普罗维登斯癌症中心近10年的研究，DRibble的安全性已通过Ⅰ/Ⅱ临床试验充分验证。

基于以上研究基础，本课题拟开展以下研究： 1. 新型DRibble疫苗对晚期NSCLC患者的疗效及对总生存期的影响，并与现有DC/CIK治疗疗效进行比较， 2.进一步研究Dribble疫苗治疗人肺癌细胞的作用机制，系统分析评价临床疗效及推广价值。

研究对象：本研究拟纳入未行前列腺癌根治术的ⅢA/ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者（约占总数的60%），接受2-6个疗程化疗，接受或不接受放疗及疾病控制阶段。 入选患者随机分为新型免疫治疗组和常规DC/CIK治疗组。

治疗方案：同种异体 DRibble 疫苗联合 DC/CIK 或 DC/CIK 单独用于治疗 IIIA 期或 B 期 NSCLC 的试验。 将研究两只手臂。 30 名患者将被随机分配到第 1 组和第 2 组。

Arm1：DRibble vaccine with DC/CIK（实验组） Arm2：DC/CIK（对照组） 方法和程序

1. 医院伦理委员会批准。
2. 根据纳入标准和排除标准招募合适的患者。
3. 签署患者知情同意书
4. DRibble肺癌疫苗的制备
5. 血样采集：采集患者外周血10ml，分离PBMC作为治疗前参考标本。
6. Day 1：DRibble组超声引导腹股沟淋巴结肿大患者注射DRibble疫苗，对照组不注射
7. Day8：采集外周血50ml，分离单核细胞和淋巴细胞
8. 强化免疫细胞扩增（生物治疗中心）：利用CD3抗体激活，IL-2促进淋巴细胞增殖杀伤细胞；GM-CSF诱导单核细胞分化为DC，联合免疫治疗组以DRibble疫苗与DC细胞共培养24 小时在带 DC/CIK 组的 Dribble 装置中。
9. 免疫细胞鉴定（临床实验室、生物治疗中心）：计数细胞数量、细胞活性、表面标志物。
10. 免疫细胞微生物检测（临床实验室、生物治疗中心）：细菌、支原体和内毒素。
11. 20-22天：免疫细胞回输患者：生理盐水洗涤细胞，悬液后静脉回输，一段时间内分几次治疗。
12. 第55天：取外周血10ml，分离PBMC体外诱导DC后，与DRibble共培养，第60天皮下注射。
13. 第75天：取外周血10ml，分离PBMC，检测T细胞免疫应答能力。

Dribble治疗效果及推广价值的系统评价： 1.临床疗效评价：比较实验组和对照组的无进展生存期和总生存期，绘制生存曲线，并进行统计学分析。 2.评价DRibble免疫反应，比较首次采集的外周血与处理后的外周血及随访阶段，检测的免疫功能检测主要包括以下内容：体外检测前后外周血DRibble特异性T细胞水平治疗，以明确抗原产生的特异性免疫反应；体外培养特异T细胞，进行识别实验，将患者自体肿瘤（如果分离成功）和体外分离自患者的多株肺癌细胞进行构建，以明确实验组产生的特异T细胞可以识别多种肺癌细胞株，意味着同种异体DRibble特异性T细胞可以对不同患者的肿瘤细胞产生反应。 3、安全性评价指标：不良反应（红肿、疼痛、皮疹、瘙痒等过敏反应）；验血指标符合标准（血常规、肝肾功能、电解质等）；生活质量（体重和BMI、血蛋白水平、体力等级、心理、情绪评价等）。