非参加者宫颈癌筛查中的自我收集样本：HPV 阳性女性的 DNA 测试和分子分类

该研究将在托斯卡纳地区进行，包括三个有组织的筛查项目：佛罗伦萨、维亚雷焦和卡拉拉。 在这些地区，根据托斯卡纳地区宫颈癌筛查的新规程，宫颈筛查计划积极邀请所有 34-64 岁的常住女性人口进行 HPV（人乳头瘤病毒）检测作为初步筛查检测（佛罗伦萨和维亚雷焦），或每 3 年进行一次巴氏试验 (Carrara)。 在上一轮筛选中被筛选计划邀请并且至少 3 年未回复的 34-64 岁女性将有资格进行邮件召回。

在涉及的 3 个筛查项目中，每年约有 63.000 名 34-64 岁年龄段的人被邀请参加筛查项目，约 40% 的女性没有响应该项目的邀请。 其中，从名单中连续选出的 8000 名符合条件的女性将随机分为两组。 目的是评估与标准书面提醒信相比，邀请自己获取的阴道-宫颈样本进行 hr-HPV 感染检测的响应率。 随机化将由协调中心 (ISPO) 使用计算机生成的随机数集中执行。 在第一年，将邀请来自 4 个筛查计划的 4000 名符合条件的女性随机抽样参加研究，并在家中自行抽样。 在对照组中，女性将收到通常召回的新邀请函，并预先预约（可以通过电话移动）到当地地区或诊所进行 HPV 筛查测试。 在选择在家中接受自我采样的干预组中，研究人员将随机分配女性到 2 个不同的自我采样设备，不同之处在于是否有防腐缓冲液。

因此，分配到干预组 (4000) 的女性组将进一步按 1:1 随机分配接受 S-wet 或 S-dry 设备。

假设传统方法与邀请函的合规性等于 15%（Giorgi Rossi 2010），本研究旨在能够检测出勤率与传统水平的 1.5% 或更大的绝对差异计划样本量为 8000 名女性的功效 (80%) 和显着性 (95%, 单侧检验)。 假设每个采样设备的样本量等于 2000 名女性，考虑到具有相同功效和显着性的约 21% 的 HPV 阳性率 (Giorgi Rossi 2010)，显着性差异或多或少等于或大于 4.0 个百分点。

该研究将在开始之前提交给协调中心和 Area Vasta 当地伦理委员会以供批准。 研究小组中的每位女性都会收到一封提醒信，说明当地的公共筛查计划将为她提供一个完全免费的装有自我取样器设备的盒子，让她可以直接在家中进行自我 HPV 筛查测试。 1 周后，研究中涉及的每个筛查项目将通过普通邮件向随机分配的女性家中寄送一封参与 HPV 筛查项目的邀请函和一个盒子，其中包含：自采样装置、使用中的 HPV 筛查传单在托斯卡纳地区计划中。 与研究相关的信息、执行自采样的说明、贴在试管上的预印标签、签署的知情同意书、调查问卷和预先贴好邮票的信封以退回自采样套件。 问卷将与自采样设备一起发送，包括与以下项目相关的项目：女性最近一次巴氏试验的日期、关于自采样性能的问题（疼痛、尴尬、可行性）、自采样中最受赞赏的内容（由他们自己、隐私、没有医生、没有窥器）以及他们不喜欢自我采样的地方（疼痛、设备、说明）。 将使用关于一般可接受性的 5 点顺序量表收集所有信息。 决定参加研究的女性可以通过普通邮件直接将带有自采样、调查问卷和签署的知情同意书（其中还包括电话联系授权）的预先贴邮票的信封寄给当地筛查项目。 在佛罗伦萨市的第二年研究中，调查人员还将评估让药店参与自行抽样分发的可能性。 在这种情况下，将通过信件邀请 500 名随机分配的女性在药店收集设备进行 HPV 筛查测试的自我采样。 同意纳入研究的药店名单将在邀请函中提供。 将评估对女性依从性和满意度的影响。 所有 HPV 分析和分子测试都将在 ISPO 的分子实验室进行，该实验室是托斯卡纳地区 HPV 筛查测试的中心实验室

DNA cobas4800 HPV检测：

HPV 将使用与常规筛查相同的 HPV 测试进行评估：Cobas 4800 HPV 测试（Roche Diagnostics）是一种定性体外测试，利用实时聚合酶链反应 (PCR) 扩增目标 DNA 来检测 14单次分析中的高风险 (HR) HPV 类型。 它是一种定性多重检测，可为 HPV 16 型和 18 型提供特定的基因分型信息，同时检测其他 12 种高危 HPV 类型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、 66 和 68）作为汇总结果。 来自细胞输入的 ß-珠蛋白用作内部控制以评估样本质量。 根据制造商的说明，该测试是在全自动 cobas 4800 系统（罗氏诊断）上进行的；根据Cobas系统软件的特定算法，一个样本被认为是阳性的。

登记女性的管理 HPV 阴性女性将在家中收到筛查测试的结果，并根据 HPV 筛查方案在 5 年后再次邀请她们。 将通过电话联系所有 HPV 呈阳性的女性进行阴道镜检查，并提供有关 HPV 和宫颈癌风险的咨询。 如果阴道镜检查呈阳性，将进行活组织检查，并根据托斯卡纳 HPV 筛查计划的规程对每位女性进行随访。 如果阴道镜检查结果为阴性，将再次邀请女性在一年内通过 HPV 检测进行控制。 在阴道镜检查期间，还将根据托斯卡纳地区批准的方案进行巴氏试验，以指导阴道镜检查后的随访。 如果一名患有 hr-HPV 的妇女没有参加，我们会努力通过电话和信件再次联系她。

HPV 阳性女性的分子分类

HPV基因分型：

将在所有 hrHPV 阳性样本中进行特定基因分型。 提取的 DNA 将进行基因分型。 在所有 HPV 阳性自收集样本中，研究人员将使用提取的 DNA 进行基因分型，进行定量甲基化分析，以便获得所研究 CpG 的甲基化状态的量化。 研究人员将评估 CADM1（细胞粘附分子 1）、MAL（髓磷脂和淋巴细胞蛋白）和 hsa-miR-124- 等基因和 microRNA 启动子区域内 CpG 岛的甲基化以及 HPV 区域 L1 和 L2 的甲基化状态. 研究人员将调查位于 HPV16 CpG 序列位置附近的每种类型的 CpG，这些位置已被强调为与宫颈上皮内肿瘤 (CIN2+) 疾病风险增加相关：L1 核苷酸位置 5601-5616 和 6457； L2核苷酸位置4261。

亚硫酸氢盐修饰：基因组 DNA 样本将使用商用 EpiTect 亚硫酸氢盐试剂盒 (QIAGEN) 进行亚硫酸氢盐修饰。 亚硫酸氢盐修饰的基因组 DNA 将立即用于焦磷酸测序或储存在 -80°C。

人类基因的人类合成甲基化和未甲基化 DNA 对照以及来自 CaSki 细胞系的 DNA 或 WHO（世界卫生组织）病毒基因的 HPV16-DNA 对照将包含在每个修饰集中以检查修饰效率。

甲基化状态：将在亚硫酸氢盐修饰的 DNA 上评估所选基因的甲基化状态。 将使用根据公开序列选择的引物进行测定（Hesselink AT 等人。 Mirabello L 等人，Wentzensen N 等人）。 如果不可用，将使用特定软件设计引物。 将为基因序列参考建立与可用基因库的链接。 初步 PCR 反应将在 35 微升总体积中进行，其中包含 1X KCl、2mM MgCl2、200 微升 dNTP、0.5 微升各引物（反义生物素化）、1.75U Taq 聚合酶和 6 微升具有适当热循环特征的修饰 DNA。 在 7500 ABI 系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）中进行扩增和实时测量。 每次运行中将包括分别针对细胞和病毒基因的甲基化和非甲基化状态的亚硫酸氢盐修饰对照。

基因分型和甲基化结果将在敏感性和特异性方面与组织学结果和随访结果相关联，这些妇女在两年随访期内诊断出有或没有临床意义的宫颈疾病。

参与研究的每个单位的作用和时间表 在研究的第一年，ISPO 将选择并随机分配女性，建立研究数据库和软件计算机验证。 将准备用于邮寄自采样设备的箱子和所有材料。

每个筛查中心都会邀请女性，将装有自采样器的盒子寄出，从被邀请的女性那里接收自采样器，在数据库中注册，将样本发送给ISPO。 ISPO L.R.P.O（区域肿瘤预防实验室）将进行 hr-HPV 检测并将结果发送到每个筛查中心。 每个筛查中心都会收到来自 ISPO 的 hr-HPV 结果，并将其发送给女性。 如果HPV阳性结果，当地筛查中心将通过电话联系女性进行阴道镜评估，进行阴道镜检查和每次进一步的随访，将结果和问卷数据记录在数据库中并参与结果评估。

在第二年，ISPO 将评估使用药房分发自我采样的可行性，并邀请女性为此目的对有反应的女性进行 hr-HPV 检测。 ISPO 还将进行 HPV 分型和甲基化分析，将所有数据记录在研究数据库中，对结果进行统计分析和评估。