Campionamento autoraccolto nello screening del cancro cervicale non partecipante: test del DNA e triage molecolare per donne positive all'HPV

Lo studio sarà condotto nella Regione Toscana includendo tre programmi di screening organizzati: Firenze, Viareggio e Carrara. In queste aree, i programmi di screening cervicale invitano attivamente tutta la popolazione femminile residente di età compresa tra 34 e 64 anni a sottoporsi al test HPV (Human Papilloma Virus) come test di screening primario (Firenze e Viareggio), secondo il nuovo protocollo per lo screening del cancro cervicale della Regione Toscana, o Pap-test ogni 3 anni (Carrara). Le donne di età compresa tra 34 e 64 anni che erano state invitate dal programma di screening nel precedente ciclo di screening e non avevano risposto per almeno 3 anni potranno beneficiare del ritiro della posta.

Nei 3 programmi di screening coinvolti, ogni anno circa 63.000 nella classe di età 34-64 anni sono invitate a partecipare al programma di screening e circa il 40% delle donne non ha risposto all'invito del programma. Di queste, 8000 donne idonee selezionate consecutivamente dalle liste saranno randomizzate in due gruppi. L'obiettivo è valutare il tasso di risposta all'invito a un campione vaginale-cervicale autoacquisito per il test di infezione da hr-HPV rispetto alla lettera di sollecito scritta standard. La randomizzazione sarà eseguita centralmente dal centro di coordinamento (ISPO) utilizzando numeri casuali generati dal computer. Nel primo anno un campione casuale di 4000 donne eleggibili dei 4 programmi di screening sarà invitato a partecipare allo studio inviando autocampionamenti a domicilio. Nel braccio di controllo, le donne riceveranno il consueto richiamo con una nuova lettera di invito con un appuntamento prefissato (può essere spostato con una telefonata) per eseguire il test di screening HPV nei distretti locali o nell'ambulatorio. Nel braccio di intervento selezionato per ricevere l'autocampionamento a casa, gli investigatori assegneranno casualmente le donne a 2 diversi dispositivi di autocampionamento che differiscono per avere o meno un tampone conservante.

Quindi il gruppo di donne assegnato nel braccio di intervento (4000) sarà ulteriormente randomizzato 1:1 per ricevere il dispositivo S-wet o S-dry.

Ipotizzando che la compliance per il metodo tradizionale con una lettera di invito sia pari al 15% (Giorgi Rossi 2010), il presente studio è finalizzato a poter rilevare una differenza assoluta pari o superiore all'1,5% nel tasso di partecipazione con livelli convenzionali di potenza (80%) e significatività (95%, test su un lato) con un campione pianificato di 8000 donne. Ipotizzando una dimensione del campione pari a 2000 donne per ciascun dispositivo di campionamento, una differenza significativa pari o superiore a 4,0 punti percentuali in più o in meno, considerando un tasso di HPV positivi di circa il 21% (Giorgi Rossi 2010) a parità di potenza e significatività.

Lo studio sarà sottoposto, prima dell'inizio, all'approvazione del Centro di Coordinamento e dei Comitati Etici Locali di Area Vasta. Ogni donna nei gruppi di studio riceverà una lettera di allerta in cui si spiega che il programma di screening pubblico locale le fornirà una scatola contenente un dispositivo di autocampionamento completamente gratuito per eseguire il test di screening per l'auto-HPV direttamente a casa. Dopo 1 settimana, ogni programma di screening coinvolto nello studio invierà per posta ordinaria a casa delle donne randomizzate una lettera di invito a partecipare al programma di screening HPV e una scatola con: dispositivo di prelievo per autocampionamento, un foglio illustrativo per lo screening HPV in uso nel Programma della Regione Toscana. Informazioni relative allo studio, istruzioni per eseguire l'autoprelievo, etichette prestampate da apporre sul tubo, il modulo di consenso informato da firmare, il questionario e una busta preaffrancata per restituire il kit di autoprelievo. I questionari verranno inviati con il dispositivo di autocampionamento includendo elementi relativi a: data dell'ultimo Pap-test delle donne, domande sulla performance dell'autocampionamento (dolore, imbarazzo, fattibilità), cosa è stato maggiormente apprezzato nell'autocampionamento (facendolo da se stessi, la privacy, l'assenza di un medico, l'assenza di speculum) e ciò che non gli è piaciuto dell'autocampionamento (dolore, dispositivo, istruzioni). Tutte le informazioni saranno raccolte utilizzando scale ordinali a 5 punti sull'accettabilità generale. Le donne che decidono di partecipare allo studio possono inviare direttamente per posta ordinaria al programma di screening locale la busta preaffrancata con l'autoprelievo, il questionario e il consenso informato firmato (che conterrà anche l'autorizzazione al contatto telefonico). Nel secondo anno di studio nella città di Firenze i ricercatori valuteranno anche la possibilità di coinvolgere le farmacie nella distribuzione dell'autocampionamento. In questo caso 500 donne randomizzate saranno invitate per lettera ad eseguire l'autoprelievo per il test di screening HPV ritirando il dispositivo in farmacia. Un elenco delle farmacie che hanno accettato di essere incluse nello studio sarà disponibile nella lettera di invito. Verrà valutato l'impatto sulla conformità e sulla soddisfazione delle donne. Tutte le analisi HPV e i test molecolari saranno eseguiti presso il Laboratorio Molecolare dell'ISPO, il laboratorio centrale per i test di screening HPV della Regione Toscana

Test HPV DNA cobas4800:

L'HPV sarà valutato con lo stesso test HPV utilizzato nello screening regolare: il test Cobas 4800 HPV (Roche Diagnostics) è un test qualitativo in vitro che utilizza l'amplificazione del DNA bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale per la rilevazione di 14 tipi di HPV ad alto rischio (HR) in un'unica analisi. Si tratta di un test qualitativo multiplex che fornisce informazioni specifiche sulla genotipizzazione per i tipi di HPV 16 e 18, rilevando contemporaneamente gli altri 12 tipi di HPV ad alto rischio (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68) come risultato aggregato. La ß-globina dall'input cellulare viene utilizzata come controllo interno per valutare la qualità del campione. Il test viene eseguito sul sistema cobas 4800 completamente automatizzato (Roche Diagnostics), secondo le istruzioni del produttore; un campione è considerato positivo secondo lo specifico algoritmo del software del sistema Cobas.

Gestione delle donne iscritte Le donne HPV negative riceveranno a casa i risultati del test di screening e saranno nuovamente invitate dopo 5 anni secondo il protocollo di screening HPV. Tutte le donne risultate positive all'HPV verranno contattate telefonicamente per eseguire la colposcopia e un counseling sul rischio HPV e cancro cervicale. Se la colposcopia sarà positiva, verrà eseguita una biopsia e ciascuna donna sarà seguita secondo il protocollo del programma di screening HPV in Toscana. Se la colposcopia risulterà negativa, le donne saranno nuovamente invitate a sottoporsi a controllo con test HPV entro un anno. Durante la colposcopia verrà eseguito anche un Pap test per guidare il follow-up post colposcopico secondo il protocollo approvato dalla Regione Toscana. Se una donna con hr-HPV non si presentava, si cercava di ricontattarla telefonicamente e poi anche per lettera.

Triage molecolare di donne positive all'HPV

Genotipizzazione dell'HPV:

La genotipizzazione specifica verrà eseguita in tutti i campioni positivi per hrHPV. Il DNA estratto sarà genotipizzato. In tutti i campioni auto-raccolti positivi all'HPV i ricercatori eseguiranno analisi quantitative di metilazione al fine di ottenere una quantificazione dello stato di metilazione dei CpG studiati, utilizzando il DNA estratto per la genotipizzazione. Gli investigatori valuteranno la metilazione delle isole CpG all'interno delle regioni promotrici di geni e microRNA come CADM1 (molecola di adesione cellulare 1), MAL (proteina della mielina e dei linfociti) e hsa-miR-124- e lo stato di metilazione delle regioni HPV L1 e L2 . Gli investigatori indagheranno per ciascun tipo i CpG situati vicino alla posizione della sequenza dei CpG dell'HPV16 che sono stati evidenziati come associati ad un aumentato rischio di malattia neoplastica intraepiteliale cervicale (CIN2 +): posizioni nucleotidiche L1 5601-5616 e 6457; Posizione del nucleotide L2 4261.

Modifica del bisolfito: i campioni di DNA genomico subiranno la modifica del bisolfito utilizzando il kit commerciale EpiTect Bisulfite (QIAGEN). Il DNA genomico modificato con bisolfito verrà utilizzato immediatamente per il pirosequenziamento o conservato a -80°C.

Controlli di DNA umano sintetico metilato e non metilato per geni umani e DNA dalla linea cellulare CaSki o un controllo HPV16-DNA dell'OMS (Organizzazione mondiale della sanità) per geni virali saranno inclusi in ogni set di modifica per verificare l'efficienza della modifica.

Stato di metilazione: Lo stato di metilazione nei geni selezionati sarà valutato sul DNA modificato con bisolfito. I saggi saranno eseguiti impiegando primers selezionati secondo le sequenze pubblicate (Hesselink AT et al. Mirabello L et al, Wentzensen N et al). Quando non disponibili, i primer saranno progettati utilizzando un software specifico. Verranno istituiti collegamenti con banche geniche disponibili per riferimenti di sequenze geniche. Una reazione preliminare di PCR sarà eseguita in un volume totale di 35 microL contenente 1X KCl, 2mM MgCl2, 200 microM dNTPs, 0.5 microM di ciascun primer (biotinilato antisenso), 1.75U Taq polimerasi e 6 microL di DNA modificato con il corretto profilo di termociclaggio. L'amplificazione e la misurazione in tempo reale sono state eseguite nel sistema 7500 ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). I controlli modificati con bisolfito per lo stato metilato e non metilato della cellula e del gene virale saranno inclusi rispettivamente in ogni corsa.

I risultati della genotipizzazione e della metilazione saranno correlati in termini di sensibilità e specificità all'esito istologico e ai risultati del follow-up in donne positive all'HPV con e senza malattia cervicale clinicamente significativa diagnosticata entro un periodo di follow-up di due anni.

Ruolo di ogni Unità coinvolta nello studio e tempistica Nel primo anno dello studio ISPO selezionerà e randomizzerà le donne, creerà il database dello studio e la validazione del software informatico. Verranno predisposte le scatole e tutto il materiale per l'invio dei dispositivi di autocampionamento.

Ogni centro di screening inviterà le donne, invierà la scatola con il dispositivo di autoprelievo, riceverà il dispositivo di autoprelievo dalle donne invitate, le registrerà nel database, invierà i campioni all'ISPO. ISPO L.R.P.O (Laboratorio Regionale di Prevenzione Oncologica) eseguirà il test hr-HPV e invierà i risultati a ciascun centro di screening. Ogni centro di screening riceverà i risultati hr-HPV dall'ISPO e li invierà alla donna. In caso di esito positivo all'HPV, il centro di screening locale contatterà telefonicamente la donna per la valutazione colposcopica, eseguirà la colposcopia e ogni ulteriore visita di follow-up, registrerà i risultati e i dati dei questionari nel database e parteciperà alla valutazione dei risultati.

Nel secondo anno ISPO valuterà la fattibilità di distribuire l'autocampionamento utilizzando le farmacie e le donne invitate a questo scopo eseguendo il test hr-HPV per le donne che hanno risposto. ISPO eseguirà anche la tipizzazione ei profili di metilazione dell'HPV, registrerà tutti i dati nel data base dello studio, eseguirà l'analisi statistica e la valutazione dei risultati.