非参加者の子宮頸がんスクリーニングにおける自己収集サンプリング: HPV 陽性女性の DNA テストと分子トリアージ

この研究は、フィレンツェ、ヴィアレッジョ、カッラーラの 3 つの組織的なスクリーニング プログラムを含むトスカーナ地方で実施さ​​れます。 これらの地域では、トスカーナ地方の子宮頸がん検診の新しいプロトコルに従って、子宮頸がん検診プログラムが 34 歳から 64 歳までのすべての居住者女性集団を一次スクリーニング検査として HPV (ヒトパピローマウイルス) 検査に積極的に招待しています (フローレンスとヴィアレッジョ)。または 3 年ごとのパップテスト (カララ)。 前回のスクリーニングでスクリーニング プログラムに招待され、少なくとも 3 年間応答しなかった 34 ～ 64 歳の女性は、メール リコールの対象となります。

関連する 3 つのスクリーニング プログラムでは、毎年 34 ～ 64 歳の年齢クラスの約 63.000 人がスクリーニング プログラムに参加するよう招待され、約 40% の女性がプログラムの招待に応じません。 その中から、リストから連続して選ばれた 8000 人の適格な女性が 2 つのグループに無作為に分けられます。 目的は、hr-HPV 感染検査のために自己採取した膣頸部サンプルへの招待に対する反応率を、標準的な書面によるリマインダー レターと比較して評価することです。 ランダム化は、コンピューターで生成された乱数を使用して、調整センター (ISPO) によって中央で実行されます。 最初の年に、4つのスクリーニングプログラムからの4000人の適格な女性のランダムサンプルが、自宅で自己サンプリングを送る研究に参加するよう招待されます. コントロール アームでは、女性は通常のリコールと、地域または診療所で HPV スクリーニング検査を実施するための予約が事前に記載された新しい招待状 (電話で移動できます) を受け取ります。 自宅で自己サンプリングを受けるように選択された介入アームでは、研究者は女性を無作為に保存バッファーの有無が異なる2つの異なる自己サンプリング装置に割り当てます。

そのため、介入群 (4000) に割り当てられた女性のグループは、S-wet または S-dry デバイスを受け取るために、1:1 でさらに無作為化されます。

招待状を使用した従来の方法の順守率が 15% であると仮定すると (Giorgi Rossi 2010)、本研究は、従来のレベルの出席率で 1.5% 以上の絶対差を検出できるように設計されています。検出力 (80%) と有意性 (95%、片側検定) を 8000 人の女性のサンプルサイズで計画しました。 各サンプリング装置のサンプル サイズが 2000 人の女性に等しいと仮定すると、HPV 陽性率が約 21% (Giorgi Rossi 2010) で同じ検出力と有意性があると考えると、4.0 パーセンテージ ポイント以上またはそれ以上の有意差があります。

研究は、開始前に、承認のために調整センターおよびエリアヴァスタ地方倫理委員会に提出されます。 研究グループの各女性は、地元のパブリック スクリーニング プログラムが、自宅で直接 HPV セルフ スクリーニング テストを行うためのセルフ サンプラー デバイスを完全に無料で含むボックスを彼女に提供することを説明する注意喚起の手紙を受け取ります。 1 週間後、研究に関与する各スクリーニング プログラムは、無作為化された女性の自宅に、HPV スクリーニング プログラムへの参加への招待状と、自己サンプル サンプリング装置、使用中の HPV スクリーニング リーフレットが入った箱を普通郵便で発送します。トスカーナ地域プログラムで。 研究に関連する情報、セルフサンプリングを実行するための指示、チューブに貼る印刷済みのラベル、署名するためのインフォームド コンセント フォーム、アンケート、セルフサンプリング キットを返却するための事前にスタンプが押された封筒。 アンケートは、次の項目に関連する項目を含むセルフサンプリング デバイスとともに送信されます。自分自身、プライバシー、医師の不在、検鏡の不在) とセルフサンプリングに関して彼らが気に入らなかったこと (痛み、装置、指示)。 すべての情報は、一般的な受容性に関する 5 段階の序数スケールを使用して収集されます。 研究に参加することを決定した女性は、自己サンプリング、質問票、および署名済みのインフォームド コンセント (電話による連絡の許可も含む) が入った事前に切手を貼った封筒を、地域のスクリーニング プログラムに普通郵便で直接送ることができます。 フィレンツェ市での 2 年目の研究では、研究者はセルフサンプリングの配布にドラッグストアを含める可能性も評価します。 この場合、無作為化された 500 人の女性が手紙で招待され、ドラッグストアでデバイスを収集して HPV スクリーニング検査の自己サンプリングを行います。 研究への参加に同意したドラッグストアのリストは、招待状に記載されています。 女性のコンプライアンスと満足度への影響が評価されます。 すべての HPV 分析と分子検査は、トスカーナ地方の HPV スクリーニング検査の中央研究所である ISPO の分子研究所で行われます。

DNA cobas4800 HPV テスト:

HPV は、通常のスクリーニングで使用されるのと同じ HPV テストで評価されます。Cobas 4800 HPV テスト (Roche Diagnostics) は、リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による標的 DNA の増幅を利用して 14 1 回の分析で高リスク (HR) HPV タイプ。 これは、HPV 16 型および 18 型の特定のジェノタイピング情報を提供すると同時に、他の 12 の高リスク HPV 型 (31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、 66 および 68) をプールした結果として。 細胞入力からのβ-グロビンは、検体の品質を評価するための内部コントロールとして使用されます。 テストは、メーカーの指示に従って、完全に自動化された cobas 4800 システム (Roche Diagnostics) で実行されています。 Cobas システム ソフトウェアの特定のアルゴリズムに従って、サンプルは陽性と見なされます。

登録された女性の管理 HPV 陰性の女性は自宅でスクリーニング検査の結果を受け取り、HPV スクリーニングプロトコルに従って 5 年後に再招待されます。 HPV 陽性となったすべての女性には、コルポスコピーと HPV および子宮頸がんのリスクに関するカウンセリングを実施するよう電話で連絡します。 膣鏡検査が陽性の場合、生検が行われ、トスカーナの HPV スクリーニング プログラムのプロトコルに従って各女性が追跡されます。 膣鏡検査が陰性の場合、女性は 1 年以内に HPV テストによるコントロールを受けるように再度招待されます。 コルポスコピー中も、トスカーナ地方で承認されたプロトコルに従って、コルポスコピー後のフォローアップをガイドするためにパップテストが行​​われます。 hr-HPV の女性が参加しなかった場合は、電話と手紙で再度連絡をとるように努めました。

HPV陽性女性の分子トリアージ

HPVジェノタイピング :

特定のジェノタイピングは、すべての hrHPV 陽性サンプルで実行されます。 抽出されたDNAは遺伝子型が決定されます。 すべての HPV 陽性の自己収集サンプルで、研究者は、ジェノタイピングのために抽出した DNA を使用して、調査した CpG のメチル化状態の定量化を得るために、定量的メチル化分析を実行します。 研究者は、CADM1 (細胞接着分子 1)、MAL (ミエリンおよびリンパ球タンパク質)、hsa-miR-124 などの遺伝子およびマイクロ RNA のプロモーター領域内の CpG アイランドのメチル化と、HPV 領域 L1 および L2 のメチル化状態を評価します。 . 研究者は、子宮頸部上皮内腫瘍性 (CIN2+) 疾患のリスク増加に関連することが強調されている HPV16 CpG の配列位置の近くに位置する CpG をタイプごとに調査します。 L2 ヌクレオチド位置 4261。

Bisulfite 修飾: ゲノム DNA サンプルは、市販の EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN) を使用して Bisulfite 修飾を受けます。 重亜硫酸塩で修飾されたゲノム DNA は、すぐにパイロシーケンシングに使用するか、-80 °C で保存します。

ヒト遺伝子のヒト合成メチル化および非メチル化 DNA コントロール、および CaSki 細胞株またはウイルス遺伝子の WHO (世界保健機関) HPV16-DNA コントロールからの DNA は、変更効率を確認するために各変更セットに含まれます。

メチル化状態: 選択した遺伝子のメチル化状態は、バイサルファイト修飾 DNA で評価されます。 アッセイは、公開された配列に従って選択されたプライマーを使用して実施されます (Hesselink AT et al. Mirabello L et al、Wentzensen N et al)。 利用できない場合、プライマーは特定のソフトウェアを使用して設計されます。 利用可能な遺伝子バンクとのリンクは、遺伝子配列参照用に設定されます。 予備 PCR 反応は、1X KCl、2 mM MgCl2、200 microM dNTP、0.5 microM の各プライマー (アンチセンス ビオチン化)、1.75U Taq ポリメラーゼ、および適切なサーモサイクリング プロファイルを備えた 6 microL 修飾 DNA を含む 35 microL の総量で実行されます。 増幅とリアルタイム測定は、7500 ABI システム (Applied Biosystems、Foster City、CA、USA) で実行されました。 細胞およびウイルス遺伝子のメチル化状態および非メチル化状態のバイサルファイト修飾コントロールがそれぞれの実行に含まれます。

ジェノタイピングとメチル化の結果は、2 年間のフォローアップ期間内に診断された臨床的に意味のある子宮頸部疾患の有無にかかわらず、HPV 陽性女性の組織学的結果とフォローアップ結果に対する感度と特異性の観点から相関します。

研究に関与する各ユニットの役割とタイムライン 研究の最初の年に、ISPO は女性を選択して無作為化し、研究データベースとソフトウェア コンピュータ検証を設定します。 セルフサンプリング装置を郵送するための箱とすべての資料が準備されます。

各スクリーニングセンターは、女性を招待し、セルフサンプリング装置を箱に入れ、招待された女性からセルフサンプリング装置を受け取り、データベースに登録し、サンプルを ISPO に送信します。 ISPO L.R.P.O (Regional Oncological Prevention Laboratory) が hr-HPV 検査を実施し、結果を各スクリーニング センターに送信します。 各スクリーニング センターは、ISPO から hr-HPV の結果を受け取り、女性に送信します。 HPV 陽性の結果が得られた場合、地域のスクリーニング センターはコルポスコピーの評価のために電話で女性に連絡し、コルポスコピーとその後のすべてのフォローアップ訪問を実施し、結果とアンケート データをデータベースに記録し、結果の評価に参加します。

2 年目に ISPO は、薬局を使用して自己サンプリングを配布する可能性を評価し、この目的のために女性を招待して、回答した女性に対して hr-HPV 検査を実施します。 ISPO は、HPV のタイピングおよびメチル化プロファイルも実行し、研究のデータベースにすべてのデータを記録し、統計分析と結果の評価を実行します。