Samodzielne pobieranie próbek od osób nieuczestniczących w badaniu przesiewowym w kierunku raka szyjki macicy: test DNA i segregacja molekularna kobiet zakażonych wirusem HPV

Badanie zostanie przeprowadzone w regionie Toskanii, w ramach trzech zorganizowanych programów badań przesiewowych: we Florencji, Viareggio i Carrara. Na tych obszarach programy badań przesiewowych szyjki macicy aktywnie zapraszają wszystkie mieszkające tam kobiety w wieku 34-64 lat na badanie HPV (wirus brodawczaka ludzkiego) jako podstawowe badanie przesiewowe (Florencja i Viareggio), zgodnie z nowym protokołem badań przesiewowych w kierunku raka szyjki macicy w regionie Toskanii, lub badanie cytologiczne co 3 lata (Carrara). Kobiety w wieku 34-64 lata, które zostały zaproszone do programu badań przesiewowych w poprzedniej rundzie badań przesiewowych i nie odpowiadały przez co najmniej 3 lata, będą kwalifikować się do odwołania pocztą.

W 3 zaangażowanych programach przesiewowych co roku około 63 000 kobiet w wieku 34-64 lata jest zapraszanych do udziału w programie przesiewowym, a około 40% kobiet nie odpowiada na zaproszenie programu. Spośród nich 8000 kwalifikujących się kobiet kolejno wybranych z list zostanie losowo podzielonych na dwie grupy. Celem jest ocena odsetka odpowiedzi na zaproszenie do samodzielnego pobrania próbki pochwy i szyjki macicy do badania zakażenia hr-HPV w porównaniu ze standardowym pisemnym listem przypominającym. Randomizacja zostanie przeprowadzona centralnie przez ośrodek koordynujący (ISPO) przy użyciu wygenerowanych komputerowo liczb losowych. W pierwszym roku losowa próba 4000 kwalifikujących się kobiet z 4 programów przesiewowych zostanie zaproszona do udziału w badaniu, wysyłając samodzielne pobieranie próbek w domu. W ramieniu kontrolnym kobiety otrzymają zwykłe zaproszenie z nowym zaproszeniem z wcześniej ustaloną wizytą (można ją przenieść za pomocą rozmowy telefonicznej) na wykonanie testu przesiewowego HPV w lokalnych okręgach lub klinice. W grupie interwencyjnej wybranej do samodzielnego pobierania próbek w domu badacze losowo przydzielą kobiety do 2 różnych urządzeń do samodzielnego pobierania próbek różniących się tym, że mają bufor konserwujący lub nie.

Tak więc grupa kobiet przydzielona do grupy interwencyjnej (4000) zostanie dalej zrandomizowana w stosunku 1:1 do otrzymania urządzenia S-wet lub S-dry.

Zakładając, że zgodność tradycyjnej metody z zaproszeniem wynosi 15% (Giorgi Rossi 2010), niniejsze badanie ma na celu wykrycie bezwzględnej różnicy 1,5% lub większej we wskaźniku frekwencji przy konwencjonalnym poziomie moc (80%) i istotność (95%, test jednostronny) przy planowanej wielkości próby 8000 kobiet. Zakładając wielkość próby równą 2000 kobiet dla każdego urządzenia do pobierania próbek, znacząca różnica równa lub większa niż 4,0 punkty procentowe mniej więcej, biorąc pod uwagę wskaźnik dodatnich wyników HPV wynoszący około 21% (Giorgi Rossi 2010) z tą samą mocą i znaczeniem.

Badanie zostanie przedłożone przed rozpoczęciem do zatwierdzenia przez Centrum Koordynacyjne i Lokalne Komitety Etyczne Regionu Vasta. Każda kobieta w grupach badawczych otrzyma list ostrzegawczy, w którym wyjaśni, że lokalny Program Badań Publicznych zapewni jej całkowicie bezpłatnie pudełko zawierające urządzenie do samodzielnego pobierania próbek, aby mogła samodzielnie wykonać test przesiewowy w kierunku HPV bezpośrednio w domu. Po 1 tygodniu każdy program badań przesiewowych biorący udział w badaniu zostanie wysłany pocztą zwykłą do domu kobiet zrandomizowanych z zaproszeniem do udziału w programie badań przesiewowych HPV oraz pudełkiem zawierającym: urządzenie do samodzielnego pobierania próbek, używaną ulotkę dotyczącą badań przesiewowych HPV w programie regionu Toskania. Informacje związane z badaniem, instrukcja samodzielnego pobierania próbek, wydrukowane etykiety do umieszczenia na probówce, formularz świadomej zgody do podpisania, kwestionariusz i wstępnie opieczętowana koperta do zwrotu zestawu do samodzielnego pobierania próbek. Wraz z urządzeniem do samodzielnego pobierania próbek zostaną przesłane kwestionariusze zawierające elementy związane z: datą ostatniego badania cytologicznego kobiet, pytania dotyczące wykonania samodzielnego pobrania próbki (ból, zażenowanie, wykonalność), co najbardziej doceniono w samodzielnym pobraniu próbki (zrobienie tego przez siebie, prywatność, brak lekarza, brak wziernika) oraz co im się nie podobało w samopobieraniu próbek (ból, urządzenie, instrukcja). Wszystkie informacje będą zbierane przy użyciu 5-punktowej skali porządkowej ogólnej akceptacji. Kobiety, które zdecydują się na udział w badaniu, mogą przesłać bezpośrednio pocztą do lokalnego programu badań przesiewowych kopertę ze znaczkiem, zawierającą samopobranie próbki, kwestionariusz oraz podpisaną świadomą zgodę (wraz z upoważnieniem do kontaktu telefonicznego). Na drugim roku studiów we Florencji śledczy ocenią również możliwość zaangażowania Drogerii w dystrybucję samopobierania próbek. W takim przypadku 500 losowo wybranych kobiet zostanie zaproszonych listownie do samodzielnego pobrania próbki do badania przesiewowego w kierunku HPV z odbiorem urządzenia w aptece. Lista drogerii, które wyraziły zgodę na udział w badaniu, będzie dostępna w zaproszeniu. Oceniony zostanie wpływ na zgodność i zadowolenie kobiet. Wszystkie analizy HPV i testy molekularne zostaną przeprowadzone w Laboratorium Molekularnym ISPO, centralnym laboratorium badań przesiewowych HPV w regionie Toskanii

Test DNA cobas4800 HPV:

HPV zostanie oceniony za pomocą tego samego testu HPV, który jest używany w regularnych badaniach przesiewowych: test Cobas 4800 HPV (Roche Diagnostics) jest jakościowym testem in vitro, który wykorzystuje amplifikację docelowego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania 14 HPV wysokiego ryzyka (HR) w jednej analizie. Jest to jakościowy test multipleksowy, który dostarcza specyficznych informacji genotypowych dla HPV typu 16 i 18, jednocześnie wykrywając pozostałe 12 typów HPV wysokiego ryzyka (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68) jako zbiorczy wynik. ß-globina z materiału komórkowego jest używana jako kontrola wewnętrzna do oceny jakości próbek. Test jest wykonywany na całkowicie zautomatyzowanym systemie cobas 4800 (Roche Diagnostics), zgodnie z instrukcjami producenta; próbka jest uznawana za pozytywną zgodnie ze specyficznym algorytmem oprogramowania systemu Cobas.

Zarządzanie zarejestrowanymi kobietami Kobiety z ujemnym wynikiem HPV otrzymają w domu wyniki testu przesiewowego i zostaną ponownie zaproszone po 5 latach zgodnie z protokołem badań przesiewowych HPV. Ze wszystkimi kobietami, u których uzyskano wynik HPV dodatni, skontaktujemy się telefonicznie w celu wykonania kolposkopii oraz porady dotyczącej ryzyka HPV i raka szyjki macicy. Jeśli kolposkopia będzie pozytywna, zostanie pobrana biopsja, a każda kobieta będzie obserwowana zgodnie z protokołem programu badań przesiewowych HPV w Toskanii. Jeśli kolposkopia będzie ujemna, kobiety zostaną ponownie zaproszone na kontrolne badanie HPV za rok. Podczas kolposkopii zostanie również pobrane badanie cytologiczne w celu ukierunkowania obserwacji po kolposkopii zgodnie z protokołem zatwierdzonym w Regionie Toskanii. W przypadku nieobecności kobiety z hr-HPV starano się ponownie skontaktować z nią telefonicznie, a następnie także listownie.

Segregacja molekularna kobiet HPV dodatnich

Genotypowanie HPV:

Specyficzne genotypowanie zostanie przeprowadzone we wszystkich próbkach hrHPV-dodatnich. Wyekstrahowane DNA zostanie poddane genotypowaniu. We wszystkich samodzielnie pobranych próbkach HPV-pozytywnych badacze przeprowadzą ilościowe analizy metylacji w celu uzyskania oceny ilościowej statusu metylacji badanych CpG, używając DNA wyekstrahowanego do genotypowania. Badacze ocenią metylację wysp CpG w regionach promotorowych genów i mikroRNA, takich jak CADM1 (cząsteczka adhezji komórkowej 1), MAL (białko mieliny i limfocytów) i hsa-miR-124- oraz stan metylacji regionów L1 i L2 HPV . Badacze zbadają dla każdego typu CpG zlokalizowane w pobliżu pozycji sekwencji CpG HPV16, które zostały wyróżnione jako związane ze zwiększonym ryzykiem śródnabłonkowej choroby nowotworowej szyjki macicy (CIN2+): pozycje nukleotydów L1 5601-5616 i 6457; Pozycja nukleotydowa L2 4261.

Modyfikacja wodorosiarczynem: Genomowe próbki DNA zostaną poddane modyfikacji wodorosiarczynem przy użyciu komercyjnego zestawu EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Zmodyfikowany wodorosiarczynem genomowy DNA zostanie natychmiast użyty do pirosekwencjonowania lub będzie przechowywany w temperaturze -80°C.

Ludzkie syntetyczne kontrole metylowanego i niemetylowanego DNA dla ludzkich genów i DNA z linii komórkowej CaSki lub kontroli WHO (Światowej Organizacji Zdrowia) HPV16-DNA dla genów wirusowych będą zawarte w każdym zestawie modyfikacji w celu sprawdzenia skuteczności modyfikacji.

Status metylacji: Status metylacji w wybranych genach zostanie oceniony na zmodyfikowanym DNA wodorosiarczynem. Testy zostaną przeprowadzone przy użyciu starterów wybranych zgodnie z opublikowanymi sekwencjami (Hesselink AT i in. Mirabello L. i in., Wentzensen N. i in.). Jeśli nie są dostępne, podkłady zostaną zaprojektowane przy użyciu specjalnego oprogramowania. Zostaną utworzone łącza z dostępnymi bankami genów dla odniesień do sekwencji genów. Wstępna reakcja PCR zostanie przeprowadzona w całkowitej objętości 35 mikroL zawierającej 1X KCl, 2mM MgCl2, 200 mikroM dNTP, 0,5 mikroM każdego startera (antysensowny biotynylowany), 1,75 U polimerazy Taq i 6 mikroL zmodyfikowanego DNA o odpowiednim profilu termocyklu. Amplifikację i pomiar w czasie rzeczywistym przeprowadzono w systemie 7500 ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Zmodyfikowane wodorosiarczynem kontrole odpowiednio dla stanu metylacji i niemetylacji genu komórki i wirusa zostaną uwzględnione w każdej serii.

Wyniki genotypowania i metylacji zostaną skorelowane pod względem czułości i specyficzności z wynikiem histologicznym i wynikami badań kontrolnych u kobiet HPV-dodatnich z i bez klinicznie znaczącej choroby szyjki macicy zdiagnozowanej w ciągu dwuletniego okresu obserwacji.

Rola każdej Jednostki zaangażowanej w badanie i ramy czasowe W pierwszym roku badania ISPO wybierze i zrandomizuje kobiety, utworzy bazę danych badania i walidację oprogramowania komputerowego. Pudełka i wszystkie materiały do ​​wysyłki urządzeń do samodzielnego pobierania próbek zostaną przygotowane.

Każdy ośrodek badań przesiewowych zaprosi kobiety, wyśle ​​pudełko z urządzeniem do samodzielnego pobierania próbek, otrzyma urządzenie od zaproszonych kobiet, zarejestruje je w bazie danych, wyśle ​​próbki do ISPO. ISPO L.R.P.O (Regionalne Laboratorium Profilaktyki Onkologicznej) wykona testy hr-HPV i prześle wyniki do każdego ośrodka badań przesiewowych. Każde centrum badań przesiewowych otrzyma wyniki hr-HPV od ISPO i prześle je kobiecie. W przypadku pozytywnego wyniku HPV lokalny ośrodek badań przesiewowych skontaktuje się telefonicznie z kobietą w celu oceny kolposkopowej, wykonania kolposkopii i wszelkich kolejnych wizyt kontrolnych, zapisania wyników i danych z kwestionariuszy w bazie danych oraz udziału w ocenie wyników.

W drugim roku ISPO oceni wykonalność dystrybucji samodzielnego pobierania próbek z wykorzystaniem aptek i zaproszonych kobiet wykonując w tym celu test hr-HPV dla kobiet odpowiadających. ISPO wykona również typowanie HPV i profile metylacji, zapisze wszystkie dane w bazie danych badania, przeprowadzi analizę statystyczną i ocenę wyników.