Échantillonnage auto-prélevé chez les non-participantes Dépistage du cancer du col de l'utérus : test ADN et triage moléculaire pour les femmes séropositives pour le VPH

L'étude sera réalisée dans la Région Toscane et comprendra trois programmes de dépistage organisés : Florence, Viareggio et Carrara. Dans ces zones, les programmes de dépistage du col de l'utérus invitent activement toute la population féminine résidente âgée de 34 à 64 ans pour le test HPV (Human Papilloma Virus) comme test de dépistage primaire (Florence et Viareggio), selon le nouveau protocole de dépistage du cancer du col de l'utérus dans la région de Toscane, ou Pap-test tous les 3 ans (Carrara). Les femmes âgées de 34 à 64 ans qui avaient été invitées par le programme de dépistage lors du précédent cycle de dépistage et qui n'avaient pas répondu pendant au moins 3 ans seront éligibles pour un rappel par courrier.

Dans les 3 programmes de dépistage impliqués, chaque année environ 63.000 dans la tranche d'âge 34-64 ans sont invités à participer au programme de dépistage et environ 40% des femmes ne répondent pas à l'invitation du programme. Parmi elles, 8 000 femmes éligibles sélectionnées consécutivement dans les listes seront randomisées en deux groupes. L'objectif est d'évaluer le taux de réponse à l'invitation à un échantillon vaginal-cervical auto-obtenu pour le test d'infection hr-HPV par rapport à la lettre de rappel écrite standard. La randomisation sera effectuée de manière centralisée par le centre de coordination (ISPO) à l'aide de nombres aléatoires générés par ordinateur. La première année, un échantillon aléatoire de 4000 femmes éligibles des 4 programmes de dépistage sera invité à participer à l'étude en envoyant un auto-échantillonnage à domicile. Dans le bras contrôle, les femmes recevront le rappel habituel avec une nouvelle lettre d'invitation avec un rendez-vous préfixé (il peut être déplacé avec un appel téléphonique) pour effectuer un test de dépistage du VPH dans les districts locaux ou la clinique. Dans le bras d'intervention sélectionné pour recevoir l'auto-échantillonnage à domicile, les enquêteurs alloueront au hasard les femmes à 2 dispositifs d'auto-échantillonnage différents différant par le fait d'avoir ou non un tampon conservateur.

Ainsi, le groupe de femmes réparties dans le bras d'intervention (4000) sera encore randomisé 1:1 pour recevoir un dispositif S-wet ou S-dry.

En supposant que la conformité pour la méthode traditionnelle avec une lettre d'invitation est égale à 15 % (Giorgi Rossi 2010), la présente étude est conçue pour être en mesure de détecter une différence absolue de 1,5 % ou plus dans le taux de fréquentation avec un niveau conventionnel de puissance (80 %) et signification (95 %, un test latéral) avec une taille d'échantillon prévue de 8 000 femmes. En supposant une taille d'échantillon égale à 2000 femmes pour chaque dispositif d'échantillonnage, une différence significative égale ou supérieure à 4,0 points de pourcentage plus ou moins, en considérant un taux de séropositivité au VPH d'environ 21 % (Giorgi Rossi 2010) avec la même puissance et la même signification.

L'étude sera soumise, avant de commencer, pour approbation au Centre de Coordination et aux Comités Ethiques Locaux de l'Area Vasta. Chaque femme des groupes d'étude recevra une lettre d'alerte expliquant que le programme local de dépistage public lui fournira une boîte contenant un dispositif d'auto-échantillonnage entièrement gratuit pour effectuer un test d'auto-dépistage du VPH directement à la maison. Après 1 semaine, chaque programme de dépistage impliqué dans l'étude enverra par courrier ordinaire au domicile des femmes randomisées une lettre d'invitation à participer au programme de dépistage HPV et une boîte avec : dispositif de prélèvement d'auto-prélèvement, une notice de dépistage HPV en cours d'utilisation dans le programme Région Toscane. Les informations liées à l'étude, les instructions pour effectuer l'auto-prélèvement, les étiquettes pré-imprimées à mettre sur le tube, le formulaire de consentement éclairé à signer, le questionnaire et une enveloppe pré-affranchie pour retourner le kit d'auto-prélèvement. Des questionnaires seront envoyés avec le dispositif d'auto-prélèvement comprenant des éléments liés à : la date du dernier test Pap de la femme, des questions sur la performance de l'auto-prélèvement (douleur, gêne, faisabilité), ce qui a été le plus apprécié dans l'auto-prélèvement (le faire en eux-mêmes, intimité, absence de médecin, absence de spéculum) et ce qu'ils n'aimaient pas concernant l'autoprélèvement (la douleur, l'appareil, la consigne). Toutes les informations seront collectées à l'aide d'échelles ordinales à 5 points sur l'acceptabilité générale. Les femmes qui décident de participer à l'étude peuvent envoyer directement par courrier ordinaire au programme de dépistage local l'enveloppe préaffranchie avec l'auto-prélèvement, le questionnaire et le consentement éclairé signé (qui comprendra également l'autorisation de contact téléphonique). En deuxième année d'étude dans la ville de Florence, les enquêteurs évalueront également la possibilité d'impliquer les pharmacies dans la distribution de l'auto-échantillonnage. Dans ce cas, 500 femmes randomisées seront invitées par courrier à effectuer un auto-échantillonnage pour le test de dépistage du VPH en récupérant le dispositif en pharmacie. Une liste des pharmacies qui ont accepté d'être incluses dans l'étude sera disponible dans la lettre d'invitation. L'impact sur la conformité et la satisfaction des femmes sera évalué. Toutes les analyses du VPH et les tests moléculaires seront effectués dans le laboratoire moléculaire de l'ISPO, le laboratoire central pour le test de dépistage du VPH dans la région de Toscane.

Test ADN cobas4800 HPV :

Le VPH sera évalué avec le même test VPH que celui utilisé pour le dépistage régulier : le test Cobas 4800 VPH (Roche Diagnostics) est un test in vitro qualitatif qui utilise l'amplification de l'ADN cible par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel pour la détection de 14 les types de HPV à haut risque (HR) en une seule analyse. Il s'agit d'un test multiplex qualitatif qui fournit des informations de génotypage spécifiques pour les types de HPV 16 et 18, tout en détectant simultanément les 12 autres types de HPV à haut risque (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 et 68) en tant que résultat groupé. La ß-globine provenant des apports cellulaires est utilisée comme contrôle interne pour évaluer la qualité des échantillons. Le test est effectué sur le système cobas 4800 entièrement automatisé (Roche Diagnostics), conformément aux instructions du fabricant ; un échantillon est considéré comme positif selon l'algorithme spécifique du logiciel du système Cobas.

Prise en charge des femmes inscrites Les femmes HPV négatives recevront à domicile les résultats du test de dépistage et elles seront réinvitées au bout de 5 ans selon le protocole de dépistage HPV. Toutes les femmes qui se sont avérées positives pour le VPH seront contactées par téléphone pour effectuer une colposcopie et un conseil sur le risque de VPH et de cancer du col de l'utérus. Si la colposcopie est positive, une biopsie sera effectuée et chaque femme sera suivie selon le protocole du programme de dépistage du VPH en Toscane. Si la colposcopie est négative, les femmes seront réinvitées à subir un contrôle avec un test HPV dans un délai d'un an. Pendant la colposcopie, un test Pap sera également effectué pour guider le suivi post-colposcopique conformément au protocole approuvé dans la région toscane. Si une femme atteinte du hr-HPV ne se présentait pas, des efforts étaient faits pour la recontacter par téléphone puis par courrier.

Triage moléculaire des femmes HPV positives

Génotypage VPH :

Un génotypage spécifique sera effectué dans tous les échantillons positifs au hrHPV. L'ADN extrait sera génotypé. Dans tous les échantillons auto-prélevés positifs au VPH, les enquêteurs effectueront des analyses quantitatives de méthylation afin d'obtenir une quantification de l'état de méthylation des CpG étudiés, en utilisant l'ADN extrait pour le génotypage. Les chercheurs évalueront la méthylation des îlots CpG dans les régions promotrices des gènes et des microARN tels que CADM1 (molécule d'adhésion cellulaire 1), MAL (protéine de la myéline et des lymphocytes) et hsa-miR-124- et l'état de méthylation des régions L1 et L2 du VPH. . Les chercheurs étudieront pour chaque type les CpG situés à proximité de la position de séquence des CpG du VPH16 qui ont été mis en évidence comme associés à un risque accru de maladie néoplasique intraépithéliale cervicale (CIN2+) : positions des nucléotides L1 5601-5616 et 6457 ; Position du nucléotide L2 4261.

Modification au bisulfite : les échantillons d'ADN génomique subiront une modification au bisulfite à l'aide du kit commercial EpiTect Bisulfite (QIAGEN). L'ADN génomique modifié au bisulfite sera utilisé immédiatement pour le pyroséquençage ou stocké à -80°C.

Des contrôles d'ADN humain synthétique méthylé et non méthylé pour les gènes humains et l'ADN de la lignée cellulaire CaSki ou un contrôle d'ADN HPV16 de l'OMS (Organisation mondiale de la santé) pour les gènes viraux seront inclus dans chaque ensemble de modifications pour vérifier l'efficacité de la modification.

Statut de méthylation : le statut de méthylation dans les gènes sélectionnés sera évalué sur l'ADN modifié au bisulfite. Les tests seront effectués en utilisant des amorces sélectionnées selon les séquences publiées (Hesselink AT et al. Mirabello L et al, Wentzensen N et al). Lorsqu'elles ne sont pas disponibles, les amorces seront conçues à l'aide d'un logiciel spécifique. Des liens avec les banques de gènes disponibles seront établis pour les références de séquences de gènes. Une réaction PCR préliminaire sera effectuée dans un volume total de 35 microL contenant 1X KCl, 2 mM MgCl2, 200 microM dNTP, 0,5 microM de chaque amorce (antisens biotinylé), 1,75 U Taq polymérase et 6 microL d'ADN modifié avec le profil de thermocyclage approprié. L'amplification et la mesure en temps réel ont été réalisées dans le système 7500 ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Des contrôles modifiés au bisulfite pour le statut méthylé et non méthylé de la cellule et du gène viral respectivement seront inclus dans chaque cycle.

Les résultats du génotypage et de la méthylation seront corrélés en termes de sensibilité et de spécificité aux résultats histologiques et aux résultats du suivi chez les femmes HPV positives avec et sans maladie cervicale cliniquement significative diagnostiquée au cours d'une période de suivi de deux ans.

Rôle de chaque unité impliquée dans l'étude et calendrier Au cours de la première année de l'étude, l'ISPO sélectionnera et randomisera les femmes, mettra en place la base de données de l'étude et le logiciel de validation informatique. Les cartons et tout le matériel pour l'envoi des dispositifs d'auto-échantillonnage seront préparés.

Chaque centre de dépistage invitera les femmes, enverra la boîte avec le dispositif d'auto-prélèvement, recevra le dispositif d'auto-prélèvement des femmes invitées, les enregistrera dans la base de données, enverra les échantillons à l'ISPO. ISPO L.R.P.O (Laboratoire Régional de Prévention Oncologique) réalisera le test hr-HPV et enverra les résultats à chaque centre de dépistage. Chaque centre de dépistage recevra les résultats hr-HPV de l'ISPO et les enverra à la femme. En cas de résultats positifs au VPH, le centre de dépistage local contactera la femme par téléphone pour une évaluation colposcopique, effectuera une colposcopie et toutes les visites de suivi ultérieures, enregistrera les résultats et les données des questionnaires dans la base de données et participera à l'évaluation des résultats.

Au cours de la deuxième année, l'ISPO évaluera la faisabilité de distribuer l'auto-échantillonnage en utilisant les pharmacies et les femmes invitées à cet effet en effectuant un test hr-HPV pour les femmes répondantes. L'ISPO effectuera également des profils de typage et de méthylation du VPH, enregistrera toutes les données dans la base de données de l'étude, effectuera une analyse statistique et une évaluation des résultats.