Saját gyűjtésű mintavétel nem résztvevők méhnyakrákszűrésén: DNS-teszt és molekuláris osztályozás HPV-pozitív nők számára

A vizsgálatot a Toszkána régióban végzik el, amely három szervezett szűrési programot tartalmaz: Firenze, Viareggio és Carrara. Ezeken a területeken a méhnyak-szűrési programok aktívan meghívják a 34-64 év közötti női lakosságot a HPV (humán papilloma vírus) tesztre, mint elsődleges szűrővizsgálatra (Firenze és Viareggio), a toszkán régió méhnyakrákszűrésének új protokollja szerint. vagy Pap-teszt 3 évente (Carrara). Postai visszahívásra jogosultak azok a 34-64 év közötti nők, akiket az előző szűrési körben a szűrőprogram meghívott, és legalább 3 évig nem válaszoltak.

A 3 érintett szűrőprogramban a 34-64 éves korosztályból évente mintegy 63 ezren kapnak meghívást a szűrőprogramra, és a nők mintegy 40%-a nem válaszolt a program meghívására. Közülük a listákról egymás után kiválasztott 8000 jogosult nőt véletlenszerűen két csoportba osztanak. A cél az, hogy értékeljük a hr-HPV-fertőzés vizsgálatra szánt hüvelyi-nyaki minta meghívására adott válaszarányt a szokásos írásos emlékeztető levélhez képest. A véletlenszerűsítést központilag a koordinációs központ (ISPO) végzi el számítógép által generált véletlenszámok segítségével. Az első évben a 4 szűrőprogramból 4000 alkalmas nőből álló véletlenszerű mintát hívnak meg a vizsgálatban való részvételre, otthoni önmintát küldve. A kontroll karban a nők a szokásos visszahívást kapják egy új meghívóval, előre rögzített időponttal (telefonon áthelyezhető) HPV szűrővizsgálat elvégzésére a helyi körzetekben vagy a rendelőben. Az otthoni önmintavételre kiválasztott intervenciós karban a vizsgálók véletlenszerűen osztják ki a nőket 2 különböző önmintavevő eszközhöz, amelyek eltérőek abban, hogy van-e vagy sem tartósítószer-puffer.

Így az intervenciós karba beosztott nők csoportja (4000) tovább randomizálva lesz 1:1 arányban az S-wet vagy S-dry eszköz fogadására.

Feltételezve, hogy a meghívólevél hagyományos módszerének megfelelősége 15% (Giorgi Rossi 2010), a jelen tanulmány úgy van megalkotva, hogy képes legyen kimutatni 1,5%-os vagy nagyobb abszolút különbséget a részvételi arányban a hagyományos szint mellett. erő (80%) és szignifikancia (95%, egyik oldali teszt) 8000 nőből álló tervezett mintaszámmal. Feltételezve, hogy minden egyes mintavevő eszköz esetében 2000 nő mintanagysága egyenlő, 4,0 százalékponttal nagyobb vagy nagyobb szignifikáns különbség, körülbelül 21%-os HPV-pozitív arányt figyelembe véve (Giorgi Rossi 2010), ugyanolyan erővel és jelentőséggel.

A tanulmányt a megkezdés előtt jóváhagyásra benyújtják a Koordinációs Központ és Vasta Területi Etikai Bizottsághoz. A vizsgálati csoportokban minden nő kap egy figyelmeztető levelet, amelyben elmagyarázzák, hogy a helyi nyilvános szűrési program teljesen ingyenesen biztosít számára egy önmintavevő készüléket tartalmazó dobozt, amellyel közvetlenül otthon végezheti el az ön-HPV szűrővizsgálatot. 1 hét elteltével minden vizsgálatban részt vevő szűrési program postai úton postai úton juttatja el a randomizált nők otthonába a HPV szűrőprogramban való részvételre felhívó levelet, valamint egy dobozt, amely tartalmazza: önmintavevő készülék, használatban lévő HPV szűrő szórólap. a Toszkána Régió Programban. A vizsgálattal kapcsolatos információk, utasítások az önmintavételhez, előre nyomtatott címkék a tubusra, a tájékoztatáson alapuló beleegyező nyilatkozat az aláíráshoz, a kérdőív és egy előre lebélyegzett boríték az önmintavevő készlet visszaküldéséhez. A kérdőíveket önmintavevő készülékkel küldjük ki, amelyek a következőkhöz kapcsolódnak: a nők legutóbbi Pap-tesztjének időpontja, az önmintavételi teljesítményre vonatkozó kérdések (fájdalom, zavar, megvalósíthatóság), mi volt a legtöbb értékelhető az önmintavétel során (ezt önmaguk, magánélet, orvos távollét, tükörhiány) és mi nem tetszett nekik az önmintavétel kapcsán (fájdalom, a készülék, az utasítás). Minden információt az általános elfogadhatóságra vonatkozó 5 pontos sorszámskálák segítségével gyűjtünk össze. Azok a nők, akik úgy döntenek, hogy részt vesznek a vizsgálatban, postai úton közvetlenül a helyi szűrőprogramnak küldhetik el az előre lebélyegzett borítékot az önmintavétellel, a kérdőívvel és az aláírt beleegyező nyilatkozattal (amely tartalmazza a telefonos kapcsolatfelvételi engedélyt is). A Firenze városában végzett tanulmány második évében a kutatók azt is értékelni fogják, hogy a drogériákat bevonják-e az önmintavétel elosztásába. Ebben az esetben 500 randomizált nőt hívnak meg levélben, hogy végezzenek önmintavételt a HPV szűrővizsgálathoz, és az eszközt a gyógyszertárban gyűjtsék össze. Azon drogériák listája, amelyek beleegyeztek abba, hogy részt vegyenek a vizsgálatban, a meghívólevélben lesz elérhető. Értékelni fogják a nők megfelelésére és elégedettségére gyakorolt ​​hatást. Minden HPV analízist és molekuláris tesztet az ISPO Molekuláris Laboratóriumában hajtanak végre, amely a HPV szűrővizsgálatok központi laboratóriuma Toszkánában.

DNS cobas4800 HPV teszt:

A HPV-t ugyanazzal a HPV-teszttel értékelik, mint a szokásos szűréseknél: a Cobas 4800 HPV-teszt (Roche Diagnostics) egy kvalitatív in vitro teszt, amely a cél-DNS valós idejű polimeráz láncreakcióval (PCR) történő amplifikációját használja fel 14 szűrés kimutatására. magas kockázatú (HR) HPV típusok egyetlen elemzésben. Ez egy kvalitatív multiplex vizsgálat, amely specifikus genotipizálási információkat szolgáltat a 16-os és 18-as HPV-típusokról, miközben egyidejűleg kimutatja a másik 12 magas kockázatú HPV-típust (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66. és 68.) összesített eredményként. A celluláris bemenetből származó ß-globint belső kontrollként használják a minta minőségének értékelésére. A tesztet a teljesen automatizált cobas 4800 rendszeren (Roche Diagnostics) végzik, a gyártó utasításai szerint; a minta a Cobas rendszerszoftver specifikus algoritmusa szerint pozitívnak minősül.

A beiratkozott nők kezelése A HPV negatív nők otthon kapják meg a szűrővizsgálat eredményét, és 5 év elteltével újra meghívják őket a HPV szűrési protokoll szerint. Minden HPV-pozitív nőt telefonon felvesznek a kolposzkópia elvégzésére, valamint tanácsadásra a HPV és a méhnyakrák kockázatával kapcsolatban. Ha a kolposzkópia pozitív lesz, biopsziát vesznek, és minden nőt követnek a toszkánai HPV szűrőprogram protokollja szerint. Ha a kolposzkópia negatív lesz, a nőket egy éven belül újra felkérik a HPV-vizsgálatra. A kolposzkópia során Pap-tesztet is végeznek, hogy irányítsák a kolposzkópos utánkövetést a toszkán régióban jóváhagyott protokoll szerint. Ha egy hr-HPV-ben szenvedő nő nem jelent meg, megpróbálták újra felvenni vele a kapcsolatot telefonon, majd levélben is.

HPV-pozitív nők molekuláris osztályozása

HPV genotipizálás:

Minden hrHPV pozitív mintában specifikus genotipizálást kell végezni. A kivont DNS-t genotipizálják. A vizsgálók minden HPV-pozitív, saját maguk által gyűjtött mintában kvantitatív metilációs elemzést végeznek, hogy a genotipizáláshoz kivont DNS felhasználásával kvantitatív módon meghatározzák a vizsgált CpG-k metilációs állapotát. A kutatók értékelni fogják a CpG-szigetek metilációját a gének és mikroRNS-ek promoter régióiban, mint például a CADM1 (sejtadhéziós molekula 1), a MAL (mielin és limfocita fehérje), valamint a hsa-miR-124- és a HPV L1 és L2 régiók metilációs állapota. . A kutatók minden típus esetében megvizsgálják a HPV16 CpG-k szekvenciapozíciójának közelében elhelyezkedő CpG-ket, amelyekről kiemelték, hogy a cervicalis intraepiteliális neoplasztikus (CIN2+) betegség fokozott kockázatával járnak együtt: L1 nukleotid pozíciók 5601-5616 és 6457; L2 nukleotid pozíció 4261.

Biszulfit módosítás: A genomi DNS-minták hidrogén-szulfit módosításon mennek keresztül a kereskedelmi EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN) segítségével. A biszulfittal módosított genomi DNS-t azonnal felhasználják a piroszekvenáláshoz, vagy -80 °C-on tárolják.

A humán gének szintetikus metilezett és metilálatlan DNS-kontrolljai, valamint a CaSki-sejtvonalból vagy a WHO (Egészségügyi Világszervezet) HPV16-DNS-ellenőrzései a vírusgénekhez minden módosítási készletben szerepelnek a módosítás hatékonyságának ellenőrzésére.

Metilációs állapot: A kiválasztott gének metilációs állapotát a biszulfittal módosított DNS-en értékeljük. A vizsgálatokat publikált szekvenciák szerint kiválasztott primerek alkalmazásával hajtják végre (Hesselink AT et al. Mirabello L és munkatársai, Wentzensen N és munkatársai). Ha nem állnak rendelkezésre, az alapozókat egy speciális szoftverrel tervezik meg. A génszekvencia-hivatkozásokhoz a rendelkezésre álló génbankokkal való kapcsolatokat hozzuk létre. Az előzetes PCR-reakciót 35 mikroliter össztérfogatban hajtjuk végre, amely 1X KCl-t, 2 mM MgCl2-t, 200 mikroM dNTP-t, 0,5 mikroM primert (antiszensz biotinilált), 1,75 U Taq polimerázt és 6 mikroL módosított DNS-t tartalmaz a megfelelő termociklusos profillal. Az amplifikációt és a valós idejű mérést a 7500 ABI rendszerben (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) végeztük. A sejt és a vírusgén metilált és nem metilált állapotának biszulfittal módosított kontrolljait minden egyes futtatás tartalmazni fogja.

A genotipizálási és metilezési eredmények érzékenység és specifitás tekintetében korrelálnak a szövettani eredménnyel, valamint a klinikailag jelentős méhnyakbetegségben szenvedő és nem klinikailag jelentős méhnyakbetegséggel nem rendelkező, kétéves követési időszakon belül diagnosztizált HPV-pozitív nők utánkövetési eredményeivel.

A vizsgálatban részt vevő egyes egységek szerepe és ütemezése A vizsgálat első évében az ISPO kiválasztja és véletlenszerűen kiválasztja a nőket, létrehozza a vizsgálati adatbázist és a szoftver számítógépes validálását. Az önmintavevő eszközök postázásához szükséges dobozok és minden anyag előkészítésre kerül.

Minden szűrőközpont meghívja a nőket, elküldi az önmintavevő készülékkel ellátott dobozt, átveszi a meghívott nőktől az önmintavevő készüléket, regisztrálja őket az adatbázisban, elküldi a mintákat az ISPO-nak. Az ISPO L.R.P.O (Regionális Onkológiai Prevenciós Laboratórium) hr-HPV-tesztet végez, és az eredményeket elküldi az egyes szűrőközpontokba. Minden szűrőközpont megkapja a hr-HPV eredményeket az ISPO-tól, és elküldi a nőnek. HPV pozitív eredmény esetén a helyi szűrőközpont telefonon felveszi a kapcsolatot a nővel kolposzkópos vizsgálat céljából, kolposzkópiát és minden további utóellenőrzést elvégz, az eredményeket és a kérdőívek adatait az adatbázisban rögzíti, és részt vesz az eredmények értékelésében.

A második évben az ISPO értékeli az önmintavétel gyógyszertári felhasználásával való terjesztésének megvalósíthatóságát, és erre a célra nőket hív meg, hr-HPV tesztet végezve a reagáló nők számára. Az ISPO HPV tipizálási és metilációs profilokat is végez, minden adatot rögzít a vizsgálat adatbázisában, elvégzi az eredmények statisztikai elemzését és értékelését.