Itse kerätyt näytteet osallistumattomien kohdunkaulan syövän seulonnassa: DNA-testi ja molekyylilajittelu HPV-positiivisille naisille

Tutkimus suoritetaan Toscanan alueella, ja se sisältää kolme järjestettyä seulontaohjelmaa: Firenze, Viareggio ja Carrara. Näillä alueilla kohdunkaulan seulontaohjelmat kutsuvat aktiivisesti kaikkia 34–64-vuotiaita naisväestöä HPV-testiin (Human Papilloma Virus) ensisijaiseksi seulontatestiksi (Firenze ja Viareggio), Toscanan alueen uuden kohdunkaulan syövän seulonnan protokollan mukaisesti. tai Pap-testi 3 vuoden välein (Carrara). 34–64-vuotiaat naiset, jotka oli kutsuttu seulontaohjelmaan edellisellä seulontakierroksella ja jotka eivät olleet vastanneet vähintään 3 vuoteen, ovat oikeutettuja postitse takaisinkutsuun.

Kolmessa mukana olevassa seulontaohjelmassa seulontaohjelmaan kutsutaan vuosittain noin 63 000 ikäluokasta 34-64 vuotta ja noin 40 % naisista ei vastannut ohjelman kutsuun. Heistä listoilta peräkkäin valittu 8000 hakukelpoista naista satunnaistetaan kahteen ryhmään. Tavoitteena on arvioida vastausprosenttia kutsuun itse otetun emättimen ja kohdunkaulan näytteeseen hr-HPV-infektiotestaukseen verrattuna tavalliseen kirjalliseen muistutuskirjeeseen. Koordinointikeskus (ISPO) suorittaa satunnaistamisen keskitetysti käyttämällä tietokoneella luotuja satunnaislukuja. Ensimmäisenä vuonna satunnaisotos, jossa on 4 000 valintakelpoista naista neljästä seulontaohjelmasta, kutsutaan osallistumaan tutkimukseen lähettämällä omanäytteen kotiin. Kontrolliryhmässä naiset saavat tavanomaisen takaisinkutsun uudella kutsukirjeellä, jossa on sovittu aika (se voidaan siirtää puhelinsoitolla) HPV-seulontatestin tekemiseen paikallisella alueella tai klinikalla. Interventioryhmässä, joka on valittu ottamaan itsenäytteitä kotona, tutkijat jakavat naiset satunnaisesti kahteen eri itsenäytteenottolaitteeseen, jotka eroavat toisistaan ​​sen suhteen, onko säilöntäainepuskuria vai ei.

Joten interventiohaaraan allokoitu naisten ryhmä (4000) satunnaistetaan edelleen suhteessa 1:1 vastaanottamaan S-wet tai S-dry -laitetta.

Olettaen, että perinteisen menetelmän noudattaminen kutsukirjeellä on 15 % (Giorgi Rossi 2010), tämä tutkimus on suunniteltu pystymään havaitsemaan vähintään 1,5 %:n absoluuttinen ero osallistumisasteessa tavanomaisilla tasoilla. teho (80 %) ja merkitsevyys (95 %, yksi puoli testi) suunnitellun otoskoon ollessa 8000 naista. Olettaen, että kunkin näytteenottolaitteen otoskoko on 2000 naista, merkittävä ero on vähintään 4,0 prosenttiyksikköä enemmän tai vähemmän, kun otetaan huomioon noin 21 %:n HPV-positiivisuus (Giorgi Rossi 2010) samalla teholla ja merkityksellä.

Tutkimus toimitetaan ennen aloittamista Koordinointikeskuksen ja Vasta-alueen paikallisten eettisten toimikuntien hyväksyttäväksi. Jokainen tutkimusryhmien nainen saa varoituskirjeen, jossa selitetään, että paikallinen julkinen seulontaohjelma antaisi hänelle täysin ilmaiseksi laatikon, joka sisältää itsenäytteenottolaitteen, jolla hän voi suorittaa HPV-seulontatestin suoraan kotona. Viikon kuluttua jokainen tutkimukseen osallistuva seulontaohjelma lähettää tavallisella postilla satunnaistettujen naisten kotiin kutsukirjeen HPV-seulontaohjelmaan ja laatikon, jossa on: omanäytteenottolaite, käytössä oleva HPV-seulontalehtinen Toscanan alueohjelmassa. Tutkimukseen liittyvät tiedot, ohjeet oman näytteenoton suorittamiseen, esipainetut etiketit putkeen kiinnitettäväksi, tietoinen suostumuslomake allekirjoitettavaksi, kyselylomake ja esileimattu kirjekuori omanäytteenottopakkauksen palauttamiseksi. Kyselylomakkeet lähetetään itsenäytteenottolaitteella, sisältäen seuraavat asiat: naisten viimeisimmän Pap-testin päivämäärä, kysymykset itsenäytteenoton suorituskyvystä (kipu, hämmennys, toteutettavuus), mitä eniten arvostettiin itsenäytteenotossa (sen tekeminen itse, yksityisyys, lääkärin poissaolo, tähystyksen puuttuminen) ja mistä he eivät pitäneet itsenäytteenotossa (kipu, laite, ohje). Kaikki tiedot kerätään yleisen hyväksyttävyyden 5 pisteen järjestysasteikolla. Naiset, jotka päättävät osallistua tutkimukseen, voivat lähettää postitse suoraan paikalliselle seulontaohjelmalle valmiiksi leimatun kirjekuoren, jossa on oma näytteenotto, kyselylomake ja allekirjoitettu tietoinen suostumus (johon sisältyy myös valtuutus puhelinkontaktiin). Toisena opiskeluvuonna Firenzen kaupungissa tutkijat arvioivat myös mahdollisuutta ottaa apteekit mukaan omanäytteiden jakeluun. Tässä tapauksessa 500 satunnaistettua naista kutsutaan kirjeitse ottamaan itsenäytteitä HPV-seulontatestiä varten ja keräämään laite apteekista. Luettelo apteekeista, jotka suostuivat osallistumaan tutkimukseen, on saatavilla kutsukirjeessä. Vaikutus naisten noudattamiseen ja tyytyväisyyteen arvioidaan. Kaikki HPV-analyysit ja molekyylitestit suoritetaan ISPO:n Molecular Laboratoryssa, joka on Toscanan alueen HPV-seulontatestien keskuslaboratorio.

DNA cobas4800 HPV-testi:

HPV arvioidaan samalla HPV-testillä, jota käytetään tavallisessa seulonnassa: Cobas 4800 HPV -testi (Roche Diagnostics) on kvalitatiivinen in vitro -testi, joka hyödyntää kohde-DNA:n monistusta reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktiolla (PCR) 14:n havaitsemiseen. korkean riskin (HR) HPV-tyypit yhdessä analyysissä. Se on kvalitatiivinen multipleksimääritys, joka tarjoaa spesifistä genotyypitystietoa HPV-tyypeille 16 ja 18 ja havaitsee samanaikaisesti muut 12 korkean riskin HPV-tyyppiä (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ja 68) yhdistettynä tuloksena. Solujen syöttämää ß-globiinia käytetään sisäisenä kontrollina näytteen laadun arvioimiseksi. Testi suoritetaan täysin automatisoidulla cobas 4800 -järjestelmällä (Roche Diagnostics) valmistajan ohjeiden mukaisesti; näytettä pidetään positiivisena Cobas-järjestelmäohjelmiston tietyn algoritmin mukaan.

Ilmoittautuneiden naisten hoito HPV-negatiiviset naiset saavat kotiin seulontatestin tulokset ja heidät kutsutaan uudelleen 5 vuoden kuluttua HPV-seulontaprotokollan mukaisesti. Kaikkiin HPV-positiivisiin naisiin otetaan yhteyttä puhelimitse kolposkopiaa ja HPV- ja kohdunkaulansyövän riskiä koskevaa neuvontaa varten. Jos kolposkopia on positiivinen, otetaan biopsia ja jokaista naista seurataan Toscanan HPV-seulontaohjelman protokollan mukaisesti. Jos kolposkopia on negatiivinen, naiset kutsutaan uudelleen HPV-kontrolliin vuoden sisällä. Kolposkopian aikana tehdään myös Pap-testi kolposkopian jälkeisen seurannan ohjaamiseksi Toscanan alueella hyväksytyn protokollan mukaisesti. Jos hr-HPV-nainen ei saapunut paikalle, häneen yritettiin saada uudelleen yhteyttä puhelimitse ja sitten myös kirjeitse.

HPV-positiivisten naisten molekulaarinen triage

HPV genotyypitys:

Spesifinen genotyypitys suoritetaan kaikissa hrHPV-positiivisissa näytteissä. Uutettu DNA genotyypitetään. Kaikissa HPV-positiivisissa itse kerätyissä näytteissä tutkijat suorittavat kvantitatiivisia metylaatioanalyysejä saadakseen kvantitatiivisen arvion tutkittujen CpG:iden metylaatiosta käyttämällä genotyypitystä varten uutettua DNA:ta. Tutkijat arvioivat CpG-saarten metylaatiota geenien ja mikro-RNA:iden promoottorialueilla, kuten CADM1 (soluadheesiomolekyyli 1), MAL (myeliini- ja lymfosyyttiproteiini) ja hsa-miR-124- ja HPV-alueiden L1 ja L2 metylaatiotila. . Tutkijat tutkivat kunkin tyypin osalta HPV16 CpG:iden sekvenssiaseman lähellä sijaitsevia CpG:itä, joiden on korostettu liittyvän kohdunkaulan intraepiteliaalisen kasvainsairauden (CIN2+) lisääntyneeseen riskiin: L1-nukleotidiasemat 5601-5616 ja 6457; L2-nukleotidiasema 4261.

Bisulfiittimodifiointi: Genomiset DNA-näytteet läpikäyvät bisulfiittimodifioinnin käyttämällä kaupallista EpiTect Bisulfite Kit -sarjaa (QIAGEN). Bisulfiitilla modifioitua genomista DNA:ta käytetään välittömästi pyrosekvensointiin tai säilytetään -80 °C:ssa.

Ihmisen synteettiset metyloidut ja metyloimattomat DNA-kontrollit ihmisgeeneille ja DNA CaSki-solulinjasta tai WHO:n (World Health Organization) HPV16-DNA-kontrolli virusgeeneille sisällytetään jokaiseen modifikaatiosarjaan modifioinnin tehokkuuden tarkistamiseksi.

Metylaatiostatus: Metylaatiotila valituissa geeneissä arvioidaan bisulfiittimodifioidulla DNA:lla. Määritykset suoritetaan käyttämällä alukkeita, jotka on valittu julkaistujen sekvenssien mukaan (Hesselink AT et ai. Mirabello L et ai., Wentzensen N et ai.). Kun alukkeet eivät ole saatavilla, ne suunnitellaan käyttämällä erityistä ohjelmistoa. Geenisekvenssiviittauksia varten luodaan linkit saatavilla oleviin geenipankkeihin. Alustava PCR-reaktio suoritetaan 35 mikrolitran kokonaistilavuudessa, joka sisältää 1 X KCl:a, 2 mM MgCl2:a, 200 mikroM dNTP:tä, 0,5 mikroM kutakin aluketta (antisense-biotinyloitu), 1,75 U Taq-polymeraasia ja 6 mikrolitraa modifioitua DNA:ta, jolla on oikea lämpösykliprofiili. Vahvistus ja reaaliaikainen mittaus suoritettiin 7500 ABI -järjestelmässä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Bisulfiittimodifioidut kontrollit solun ja virusgeenin metyloituneen ja metyloitumattoman tilan osalta sisällytetään jokaiseen ajoon.

Genotyypitys- ja metylaatiotulokset korreloidaan herkkyyden ja spesifisyyden suhteen histologiseen lopputulokseen ja seurantatuloksiin HPV-positiivisilla naisilla, joilla on kliinisesti merkityksellinen kohdunkaulan sairaus ja joilla ei ole todettu kahden vuoden seurantajakson aikana.

Jokaisen tutkimukseen osallistuvan yksikön rooli ja aikajana Tutkimuksen ensimmäisenä vuonna ISPO valitsee ja satunnaisoi naiset, perustaa tutkimustietokannan ja ohjelmiston tietokonevalidoinnin. Laatikot ja kaikki materiaalit itsenäytteenottolaitteiden postitusta varten valmistetaan.

Jokainen seulontakeskus kutsuu naisia, lähettää laatikon itsenäytteenottolaitteella, vastaanottaa itsenäytteenottolaitteen kutsutuilta naisilta, rekisteröi heidät tietokantaan, lähettää näytteet ISPO:lle. ISPO L.R.P.O (Regional Oncological Prevention Laboratory) suorittaa hr-HPV-testauksen ja lähettää tulokset jokaiseen seulontakeskukseen. Jokainen seulontakeskus vastaanottaa hr-HPV-tulokset ISPO:lta ja lähettää ne naiselle. HPV-positiivisten tulosten tapauksessa paikallinen seulontakeskus ottaa naiseen yhteyttä puhelimitse kolposkopiaarviointia varten, tekee kolposkopian ja jokaisen myöhemmän seurantakäynnin, kirjaa tulokset ja kyselylomakkeen tiedot tietokantaan ja osallistuu tulosten arviointiin.

Toisena vuonna ISPO arvioi mahdollisuutta jakaa itsenäytteitä apteekkien avulla ja kutsui tähän tarkoitukseen naiset suorittamaan hr-HPV-testin vastaaville naisille. ISPO suorittaa myös HPV-tyypitys- ja metylaatioprofiilit, tallentaa kaikki tiedot tutkimuksen tietokantaan, suorittaa tilastollisen analyysin ja tulosten arvioinnin.