Zelf verzamelde monsters bij screening op baarmoederhalskanker die niet aanwezig was: DNA-test en moleculaire triage voor HPV-positieve vrouwen

De studie zal worden uitgevoerd in de Toscaanse regio en omvat drie georganiseerde screeningprogramma's: Florence, Viareggio en Carrara. In deze gebieden nodigen screeningprogramma's voor baarmoederhalskanker actief alle vrouwelijke inwoners van 34-64 jaar uit voor de HPV-test (Human Papilloma Virus) als primaire screeningstest (Florence en Viareggio), volgens het nieuwe protocol voor screening op baarmoederhalskanker in de regio Toscane, of Pap-test om de 3 jaar (Carrara). Vrouwen van 34-64 jaar die in de vorige screeningsronde door het bevolkingsonderzoek zijn uitgenodigd en minimaal 3 jaar niet hebben gereageerd, komen in aanmerking voor een mail recall.

In de 3 betrokken bevolkingsonderzoeken worden jaarlijks circa 63.000 in de leeftijdsklasse 34-64 jaar uitgenodigd voor deelname aan het bevolkingsonderzoek en circa 40% van de vrouwen geeft geen gehoor aan de uitnodiging van het bevolkingsonderzoek. Van hen worden 8000 in aanmerking komende vrouwen die achtereenvolgens uit de lijsten worden geselecteerd, gerandomiseerd in twee groepen. Het doel is om de respons op een uitnodiging voor een zelf verkregen vaginaal-cervicaal monster voor hr-HPV-infectietesten te evalueren in vergelijking met de standaard schriftelijke herinneringsbrief. Randomisatie zal centraal worden uitgevoerd door het coördinatiecentrum (ISPO) met behulp van computergegenereerde toevalsgetallen. In het eerste jaar wordt een willekeurige steekproef van 4000 in aanmerking komende vrouwen uit de 4 screeningsprogramma's uitgenodigd om deel te nemen aan het onderzoek door zelfbemonstering naar huis te sturen. In de controle-arm ontvangen de vrouwen de gebruikelijke terugroepactie met een nieuwe uitnodigingsbrief met een vooraf bepaalde afspraak (deze kan worden verplaatst met een telefoontje) om een ​​HPV-screeningstest uit te voeren in de lokale districten of kliniek. In de interventiearm die is geselecteerd om zelfafname thuis te ontvangen, zullen de onderzoekers de vrouwen willekeurig toewijzen aan 2 verschillende apparaten voor zelfafname, die verschillen in het al dan niet hebben van een conserveringsbuffer.

Dus de groep vrouwen die is toegewezen aan de interventie-arm (4000) zal verder 1:1 worden gerandomiseerd voor het ontvangen van een S-wet- of S-dry-apparaat.

Ervan uitgaande dat de naleving voor de traditionele methode met een uitnodigingsbrief gelijk is aan 15% (Giorgi Rossi 2010), is de huidige studie ontworpen om een ​​absoluut verschil van 1,5% of meer in het aanwezigheidspercentage te kunnen detecteren met een conventioneel niveau van power (80%) en significantie (95%, eenzijdige test) met een geplande steekproefomvang van 8000 vrouwen. Uitgaande van een steekproefomvang gelijk aan 2000 vrouwen voor elk bemonsteringsapparaat, een significant verschil gelijk aan of groter dan 4,0 procentpunten meer of minder, rekening houdend met een HPV-positief percentage van ongeveer 21% (Giorgi Rossi 2010) met dezelfde kracht en significantie.

Het onderzoek zal, alvorens te beginnen, ter goedkeuring worden voorgelegd aan het Coordinating Centre en de lokale ethische commissies van Area Vasta. Elke vrouw in de studiegroepen zal een waarschuwingsbrief ontvangen waarin wordt uitgelegd dat het lokale openbare screeningsprogramma haar volledig gratis een doos met een apparaat voor zelfafname zou geven om zelf-HPV-screeningstest rechtstreeks thuis uit te voeren. Na 1 week zal elk screeningsprogramma dat betrokken is bij het onderzoek per gewone post naar huis van de gerandomiseerde vrouwen een uitnodigingsbrief sturen om deel te nemen aan het HPV-screeningprogramma en een doos met: zelfafname-afnameapparaat, een HPV-screeningfolder in gebruik in het regioprogramma Toscane. Informatie met betrekking tot het onderzoek, instructies om zelfafname uit te voeren, voorgedrukte etiketten om op de buis te plakken, het toestemmingsformulier om te ondertekenen, de vragenlijst en een voorgefrankeerde envelop om de zelfafnameset terug te sturen. Er worden vragenlijsten meegestuurd met een apparaat voor zelfafname, inclusief items met betrekking tot: datum van de laatste Pap-test van vrouwen, vragen over de zelfafnameprestaties (pijn, verlegenheid, haalbaarheid), wat het meest werd gewaardeerd in de zelfafname (doen door zichzelf, privacy, afwezigheid van een arts, afwezigheid van speculum) en wat ze niet leuk vonden aan zelfafname (pijn, het apparaat, de instructie). Alle informatie zal worden verzameld met behulp van 5-punts ordinale schalen op de algemene aanvaardbaarheid. Vrouwen die besluiten deel te nemen aan het onderzoek kunnen de voorgefrankeerde envelop met de zelfafname, de vragenlijst en de ondertekende geïnformeerde toestemming (waarin ook de machtiging voor telefonisch contact wordt opgenomen) rechtstreeks per gewone post naar het lokale screeningsprogramma sturen. In het tweede studiejaar in de stad Florence zullen de onderzoekers ook de mogelijkheid evalueren om drogisterijen te betrekken bij de distributie van zelfafname. In dit geval worden 500 gerandomiseerde vrouwen per brief uitgenodigd om zelfafname voor HPV-screeningstest uit te voeren en het apparaat op te halen in de drogisterij. Een lijst met drogisterijen die ermee hebben ingestemd om in het onderzoek te worden opgenomen, zal beschikbaar zijn in de uitnodigingsbrief. De impact op naleving en tevredenheid van vrouwen zal worden geëvalueerd. Alle HPV-analyse en moleculaire tests zullen worden uitgevoerd in het moleculaire laboratorium van ISPO, het centrale laboratorium voor HPV-screeningstest in de regio Toscane

DNA cobas4800 HPV-test:

HPV wordt geëvalueerd met dezelfde HPV-test die wordt gebruikt bij reguliere screening: de Cobas 4800 HPV-test (Roche Diagnostics) is een kwalitatieve in-vitrotest die gebruikmaakt van amplificatie van doel-DNA door real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) voor de detectie van 14 hoog-risico (HR) HPV-typen in één enkele analyse. Het is een kwalitatieve multiplex-assay die specifieke genotyperingsinformatie levert voor HPV-typen 16 en 18, terwijl tegelijkertijd de andere 12 hoog-risico HPV-typen worden gedetecteerd (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 en 68) als gepoold resultaat. ß-globine uit cellulaire invoer wordt gebruikt als een interne controle om de kwaliteit van monsters te beoordelen. De test wordt uitgevoerd op het volledig geautomatiseerde cobas 4800-systeem (Roche Diagnostics), volgens de instructies van de fabrikant; een monster wordt als positief beschouwd volgens het specifieke algoritme van de Cobas-systeemsoftware.

Management van geregistreerde vrouwen HPV-negatieve vrouwen krijgen thuis de resultaten van de screeningstest en worden na 5 jaar opnieuw uitgenodigd volgens het HPV-screeningsprotocol. Alle vrouwen die HPV-positief zijn geworden, zullen telefonisch worden gecontacteerd voor colposcopie en advies over het risico op HPV en baarmoederhalskanker. Als de colposcopie positief is, wordt er een biopsie genomen en wordt elke vrouw gevolgd volgens het protocol van het HPV-screeningprogramma in Toscane. Als colposcopie negatief is, worden vrouwen binnen een jaar opnieuw uitgenodigd voor controle met HPV-test. Tijdens de colposcopie wordt ook een uitstrijkje afgenomen om de postcolposcopische follow-up te begeleiden volgens het protocol dat is goedgekeurd in de Toscaanse regio. Als een vrouw met hr-HPV niet kwam opdagen, werd getracht haar telefonisch en daarna ook weer per brief te bereiken.

Moleculaire triage van HPV-positieve vrouwen

HPV-genotypering:

Specifieke genotypering zal worden uitgevoerd in alle hrHPV-positieve monsters. Het geëxtraheerde DNA wordt gegenotypeerd. In alle HPV-positieve, zelf verzamelde monsters zullen de onderzoekers kwantitatieve methylatieanalyses uitvoeren om een ​​kwantificering te verkrijgen voor de methylatiestatus van de onderzochte CpG's, met behulp van geëxtraheerd DNA voor genotypering. De onderzoekers zullen de methylering van CpG-eilanden in promotorregio's van genen en microRNA's zoals CADM1 (celadhesiemolecuul 1), MAL (myeline- en lymfocyteneiwit) en hsa-miR-124- en methyleringsstatus van de HPV-regio's L1 en L2 evalueren. . De onderzoekers zullen voor elk type de CpG's onderzoeken die zich in de buurt van de sequentiepositie van HPV16 CpG's bevinden en die zijn gemarkeerd als geassocieerd met een verhoogd risico op cervicale intra-epitheliale neoplastische (CIN2+) ziekte: L1-nucleotideposities 5601-5616 en 6457; L2 nucleotide positie 4261.

Bisulfietmodificatie: Genomische DNA-monsters ondergaan bisulfietmodificatie met behulp van de in de handel verkrijgbare EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Het bisulfiet-gemodificeerde genomische DNA zal onmiddellijk worden gebruikt voor pyrosequencing of worden bewaard bij -80°C.

Menselijke synthetische gemethyleerde en niet-gemethyleerde DNA-controles voor menselijke genen en DNA van de CaSki-cellijn of een HPV16-DNA-controle van de WHO (Wereldgezondheidsorganisatie) voor virale genen zullen in elke modificatieset worden opgenomen om de modificatie-efficiëntie te controleren.

Methylatiestatus: Methylatiestatus in de geselecteerde genen zal geëvalueerd worden op het met bisulfiet gemodificeerde DNA. De assays zullen worden uitgevoerd met behulp van primers die zijn geselecteerd op basis van gepubliceerde sequenties (Hesselink AT et al. Mirabello L e.a., Wentzensen N e.a.). Indien niet beschikbaar, worden primers ontworpen met behulp van specifieke software. Er zullen koppelingen worden gemaakt met beschikbare genenbanken voor gensequentiereferenties. Een voorbereidende PCR-reactie zal worden uitgevoerd in een totaal volume van 35 microL met 1X KCl, 2 mM MgCl2, 200 microM dNTP's, 0,5 microM van elke primer (antisense gebiotinyleerd), 1,75 U Taq-polymerase en 6 microL gemodificeerd DNA met het juiste thermocyclingprofiel. Amplificatie en real-time meting werden uitgevoerd in het 7500 ABI-systeem (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS). Met bisulfiet gemodificeerde controles voor respectievelijk de gemethyleerde en niet-gemethyleerde status van cel- en viraal gen zullen in elke run worden opgenomen.

De resultaten van genotypering en methylering zullen worden gecorreleerd in termen van gevoeligheid en specificiteit voor het histologische resultaat en de follow-upresultaten bij HPV-positieve vrouwen met en zonder klinisch betekenisvolle baarmoederhalsziekte, gediagnosticeerd binnen een follow-upperiode van twee jaar.

Rol van elke eenheid die betrokken is bij de studie en tijdlijn In het eerste jaar van de studie zal ISPO vrouwen selecteren en randomiseren, de studiedatabase opzetten en de software computervalidatie. De dozen en alle materialen voor de verzending van zelfafnameapparatuur worden voorbereid.

Elk screeningscentrum nodigt de vrouwen uit, stuurt de doos met het zelfafnameapparaat op, ontvangt het zelfafnameapparaat van de uitgenodigde vrouwen, registreert ze in de database en stuurt de stalen naar ISPO. ISPO L.R.P.O (Regionaal Laboratorium voor Oncologische Preventie) voert hr-HPV-testen uit en stuurt de resultaten naar elk screeningscentrum. Elk screeningscentrum ontvangt de hr-HPV-resultaten van ISPO en stuurt deze naar de vrouw. In het geval van HPV-positieve resultaten zal het lokale screeningscentrum telefonisch contact opnemen met de vrouw voor colposcopische beoordeling, colposcopie uitvoeren en alle volgende vervolgbezoeken, de resultaten en vragenlijstgegevens in de database opnemen en deelnemen aan de evaluatie van de resultaten.

In het tweede jaar zal ISPO de haalbaarheid evalueren om de zelfafname te distribueren met behulp van apotheken en daartoe uitgenodigde vrouwen die een hr-HPV-test uitvoeren voor reagerende vrouwen. ISPO zal ook HPV-typering en methyleringsprofielen uitvoeren, alle gegevens in de database van het onderzoek opnemen, statistische analyses uitvoeren en de resultaten evalueren.