Самостоятельный сбор образцов при скрининге рака шейки матки, не присутствовавших на месте: анализ ДНК и молекулярная сортировка для ВПЧ-позитивных женщин

Исследование будет проводиться в регионе Тоскана, включая три организованные программы скрининга: Флоренция, Виареджио и Каррара. В этих регионах программы скрининга шейки матки активно приглашают все постоянно проживающее женское население в возрасте 34–64 лет для прохождения теста на ВПЧ (вирус папилломы человека) в качестве первичного скринингового теста (Флоренция и Виареджио) в соответствии с новым протоколом скрининга рака шейки матки в регионе Тоскана. или Пап-тест каждые 3 года (Каррара). Женщины в возрасте 34-64 лет, которые были приглашены программой скрининга в предыдущем раунде скрининга и не ответили на запрос в течение как минимум 3 лет, будут иметь право на отзыв по почте.

В трех задействованных программах скрининга каждый год около 63 000 человек в возрастной категории 34-64 года приглашаются для участия в программе скрининга, и около 40% женщин не откликнулись на приглашение программы. Из них 8000 подходящих женщин, последовательно выбранных из списков, будут рандомизированы в две группы. Цель состоит в том, чтобы оценить уровень ответов на приглашение сдать образец из влагалища и шейки матки для тестирования на инфекцию hr-HPV по сравнению со стандартным письменным напоминанием. Рандомизация будет осуществляться централизованно координационным центром (ISPO) с использованием случайных чисел, сгенерированных компьютером. В течение первого года случайная выборка из 4000 женщин из 4 программ скрининга будет приглашена для участия в исследовании с отправкой самоотбора на дому. В контрольной группе женщины получат обычный отзыв с новым письмом-приглашением с префиксом встречи (его можно перенести с помощью телефонного звонка) для проведения скринингового теста на ВПЧ в местных районах или клинике. В группе вмешательства, выбранной для самостоятельного взятия проб в домашних условиях, исследователи случайным образом распределят женщин к двум различным устройствам для самостоятельного взятия проб, отличающимся наличием или отсутствием консервирующего буфера.

Таким образом, группа женщин, выделенная в группу вмешательства (4000), будет дополнительно рандомизирована 1: 1 для получения устройства S-wet или S-dry.

Предполагая, что соответствие для традиционного метода с письмом-приглашением равно 15% (Giorgi Rossi 2010), настоящее исследование предназначено для выявления абсолютной разницы в 1,5% или более в уровне посещаемости с обычным уровнем посещаемости. мощность (80%) и значимость (95%, односторонний тест) при запланированном размере выборки 8000 женщин. Предполагая размер выборки, равный 2000 женщин для каждого устройства для отбора проб, значительная разница равна или превышает 4,0 процентных пункта больше или меньше, учитывая положительный уровень ВПЧ около 21% (Giorgi Rossi 2010) с той же силой и значимостью.

Перед началом исследование будет представлено на утверждение Координационному центру и Местным комитетам по этике региона Васта. Каждая женщина в исследовательской группе получит предупреждающее письмо, в котором объясняется, что местная программа общественного скрининга совершенно бесплатно предоставит ей коробку, содержащую устройство для самостоятельного взятия проб, для самостоятельного проведения скринингового теста на ВПЧ непосредственно дома. Через 1 неделю каждая программа скрининга, участвующая в исследовании, отправит обычной почтой на дом рандомизированных женщин письмо-приглашение для участия в программе скрининга на ВПЧ и коробку с: устройством для самостоятельного отбора проб, используемой брошюрой по скринингу на ВПЧ. в программе региона Тоскана. Информация, относящаяся к исследованию, инструкции по самостоятельному взятию проб, предварительно напечатанные этикетки для наклеивания на пробирку, форма информированного согласия для подписи, анкета и предварительно проштампованный конверт для возврата набора для самостоятельного взятия проб. Анкеты будут отправлены вместе с устройством для самостоятельного взятия проб, включая вопросы, касающиеся: даты последнего мазка Папаниколау у женщин, вопросов о характеристиках самостоятельного взятия проб (боль, смущение, осуществимость), что больше всего ценится при самостоятельном взятии проб (выполнение себя, уединение, отсутствие врача, отсутствие зеркала) и что не понравилось в самостоятельном взятии проб (боль, прибор, инструкция и т.д.). Вся информация будет собираться с использованием 5-балльной порядковой шкалы общей приемлемости. Женщины, решившие принять участие в исследовании, могут отправить обычной почтой напрямую в местную программу скрининга предварительно проштампованный конверт с бланком для самостоятельного взятия проб, анкетой и подписанным информированным согласием (которое также будет включать разрешение на телефонный контакт). На втором году обучения во Флоренции исследователи также оценят возможность привлечения аптек к распространению самостоятельных проб. В этом случае 500 рандомизированных женщин будут приглашены письмом для самостоятельного взятия проб на скрининг-тест на ВПЧ для получения устройства в аптеке. Список аптек, давших согласие на участие в исследовании, будет доступен в письме-приглашении. Будет оценено влияние на соблюдение и удовлетворенность женщин. Все анализы на ВПЧ и молекулярные тесты будут проводиться в молекулярной лаборатории ISPO, центральной лаборатории скрининговых тестов на ВПЧ в регионе Тоскана.

ДНК-тест на ВПЧ cobas4800:

ВПЧ будет оцениваться с помощью того же теста на ВПЧ, который используется при регулярном скрининге: тест на ВПЧ Cobas 4800 (Roche Diagnostics) представляет собой качественный тест in vitro, в котором используется амплификация ДНК-мишени с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для обнаружения 14 типы ВПЧ высокого риска (HR) в одном анализе. Это качественный мультиплексный анализ, который предоставляет специфическую информацию о генотипировании для типов ВПЧ 16 и 18, одновременно обнаруживая другие 12 типов ВПЧ высокого риска (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) в виде объединенного результата. ß-глобин из клеток используется в качестве внутреннего контроля для оценки качества образцов. Тест проводится на полностью автоматизированной системе cobas 4800 (Roche Diagnostics) в соответствии с инструкциями производителя; образец считается положительным в соответствии со специальным алгоритмом программного обеспечения системы Cobas.

Ведение зарегистрированных женщин ВПЧ-отрицательные женщины получают дома результаты скринингового теста и повторно приглашаются через 5 лет в соответствии с протоколом скрининга на ВПЧ. Со всеми женщинами, которые оказались ВПЧ-позитивными, свяжутся по телефону для проведения кольпоскопии и консультирования по поводу риска ВПЧ и рака шейки матки. Если кольпоскопия будет положительной, будет взята биопсия, и каждая женщина будет наблюдаться в соответствии с протоколом программы скрининга на ВПЧ в Тоскане. Если кольпоскопия будет отрицательной, женщину повторно пригласят на контрольное обследование на ВПЧ в течение года. Во время кольпоскопии также будет взят мазок Папаниколау, чтобы контролировать последующее кольпоскопическое наблюдение в соответствии с протоколом, утвержденным в регионе Тоскана. Если женщина с hr-HPV не присутствовала, предпринимались попытки снова связаться с ней по телефону, а затем и по почте.

Молекулярная сортировка ВПЧ-позитивных женщин

Генотипирование ВПЧ:

Специфическое генотипирование будет проводиться во всех положительных образцах врВПЧ. Извлеченная ДНК будет генотипирована. Во всех образцах, положительных на ВПЧ, собранных самостоятельно, исследователи проведут количественный анализ метилирования, чтобы получить количественную оценку статуса метилирования исследованных CpG, используя ДНК, извлеченную для генотипирования. Исследователи будут оценивать метилирование островков CpG в промоторных областях генов и микроРНК, таких как CADM1 (молекула клеточной адгезии 1), MAL (миелин и белок лимфоцитов), а также hsa-miR-124 и статус метилирования областей HPV L1 и L2. . Исследователи будут исследовать для каждого типа CpG, расположенные рядом с положением последовательности CpG HPV16, которые были выделены как связанные с повышенным риском цервикального внутриэпителиального неопластического заболевания (CIN2+): положения нуклеотидов L1 5601-5616 и 6457; Нуклеотид L2 в положении 4261.

Бисульфитная модификация: Образцы геномной ДНК будут подвергнуты бисульфитной модификации с использованием коммерческого набора EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Геномная ДНК, модифицированная бисульфитом, будет немедленно использоваться для пиросеквенирования или храниться при температуре -80°C.

Синтетические метилированные и неметилированные ДНК-контроли человека для генов человека и ДНК из клеточной линии CaSki или контроль ДНК HPV16 ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) для вирусных генов будут включены в каждый набор модификаций для проверки эффективности модификации.

Статус метилирования: Статус метилирования в выбранных генах будет оцениваться на модифицированной бисульфитом ДНК. Анализы будут проводиться с использованием праймеров, выбранных в соответствии с опубликованными последовательностями (Hesselink AT et al. Mirabello L и др., Wentzensen N и др.). Если праймеры недоступны, они будут разработаны с использованием специального программного обеспечения. Ссылки с доступными генными банками будут установлены для ссылок на последовательности генов. Предварительную реакцию ПЦР проводят в общем объеме 35 мкл, содержащем 1X KCl, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTP, 0,5 мкМ каждого праймера (антисмыслового биотинилированного), 1,75 ЕД полимеразы Taq и 6 мкл модифицированной ДНК с надлежащим профилем термоциклирования. Амплификацию и измерение в реальном времени проводили в системе 7500 ABI (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Модифицированные бисульфитом контроли для метилированного и неметилированного статуса клетки и вирусного гена соответственно будут включены в каждый цикл.

Результаты генотипирования и метилирования будут соотнесены с точки зрения чувствительности и специфичности к гистологическому исходу и результатам последующего наблюдения у ВПЧ-позитивных женщин с клинически значимым заболеванием шейки матки и без него, диагностированным в течение двухлетнего периода наблюдения.

Роль каждого подразделения, участвующего в исследовании, и сроки В первый год исследования ISPO выберет и рандомизирует женщин, создаст базу данных исследования и проверит компьютерное программное обеспечение. Коробки и все материалы для отправки устройств для самостоятельного взятия проб будут подготовлены.

Каждый центр скрининга пригласит женщин, отправит коробку с устройством для взятия проб, получит устройство для взятия проб от приглашенных женщин, зарегистрирует их в базе данных, отправит образцы в ISPO. ISPO L.R.P.O (Областная онкологическая профилактическая лаборатория) проведет тестирование на ВПЧ и отправит результаты в каждый центр скрининга. Каждый скрининговый центр получит результаты hr-HPV от ISPO и отправит их женщине. В случае положительного результата на ВПЧ местный скрининговый центр свяжется с женщиной по телефону для кольпоскопического обследования, проведет кольпоскопию и каждые последующие контрольные визиты, запишет результаты и данные анкеты в базу данных и примет участие в оценке результатов.

В течение второго года ISPO оценит возможность проведения самостоятельного отбора проб с использованием аптек и приглашенных для этой цели женщин, выполняющих тест на ВПЧ для ответивших женщин. ISPO также выполнит профили типирования и метилирования ВПЧ, запишет все данные в базу данных исследования, проведет статистический анализ и оценку результатов.