Selvindsamlet prøveudtagning i ikke-deltagere livmoderhalskræftscreening: DNA-test og molekylær triage for HPV-positive kvinder

Undersøgelsen vil blive udført i Toscana-regionen, herunder tre organiserede screeningsprogrammer: Firenze, Viareggio og Carrara. I disse områder inviterer livmoderhalsscreeningsprogrammer aktivt hele den hjemmehørende kvindelige befolkning i alderen 34-64 år til HPV (Human Papilloma Virus) test som primær screeningstest (Florence og Viareggio), i henhold til den nye protokol for livmoderhalskræftscreening i Toscana-regionen, eller Pap-test hvert 3. år (Carrara). Kvinder i alderen 34-64 år, som var blevet inviteret af screeningsprogrammet i den foregående screeningsrunde og havde undladt at svare i mindst 3 år, vil være berettiget til tilbagekaldelse via mail.

I de 3 involverede screeningsprogrammer inviteres hvert år omkring 63.000 i aldersklassen 34-64 år til at deltage i screeningsprogrammet, og omkring 40 % af kvinderne har ikke reageret på invitationen til programmet. Ud af dem vil 8000 berettigede kvinder, der er udvalgt fortløbende fra listerne, blive randomiseret i to grupper. Formålet er at evaluere responsraten på invitation til en selvudtaget vaginal-cervikal prøve til hr-HPV-infektionstest sammenlignet med standard skriftlig rykkerskrivelse. Randomisering vil blive udført centralt af koordineringscentret (ISPO) ved hjælp af computergenererede tilfældige tal. I det første år vil en tilfældig stikprøve på 4000 kvalificerede kvinder fra de 4 screeningsprogrammer blive inviteret til at deltage i undersøgelsen og sende selvprøver hjem. I kontrolarmen vil kvinderne modtage den sædvanlige tilbagekaldelse med et nyt invitationsbrev med en forudgående aftale (det kan flyttes med et telefonopkald) til at udføre HPV-screeningstest i de lokale distrikter eller klinikker. I den interventionsarm, der er udvalgt til at modtage selvprøvetagning i hjemmet, vil efterforskerne tilfældigt fordele kvinderne til 2 forskellige selvprøveudtagningsanordninger, der er forskellige med hensyn til at have eller ikke have en konserverende buffer.

Så gruppen af ​​kvinder allokeret i interventionsarmen (4000) vil blive randomiseret yderligere 1:1 for at modtage S-våd eller S-tør enhed.

Forudsat at overensstemmelsen for den traditionelle metode med et invitationsbrev er lig med 15 % (Giorgi Rossi 2010), er nærværende undersøgelse designet til at kunne påvise en absolut forskel på 1,5 % eller mere i deltagelsesprocenten med et konventionelt niveau på magt (80%) og signifikans (95%, en sidetest) med en planlagt stikprøvestørrelse på 8000 kvinder. Hvis man antager en prøvestørrelse svarende til 2000 kvinder for hvert prøveudtagningsudstyr, er en signifikant forskel lig med eller større end 4,0 procentpoint mere eller mindre, i betragtning af en HPV-positiv rate på omkring 21 % (Giorgi Rossi 2010) med samme styrke og signifikans.

Undersøgelsen vil blive forelagt, før start, til godkendelse til Koordineringscenteret og Area Vasta lokale etiske udvalg. Hver kvinde i undersøgelsesgrupperne vil modtage et advarselsbrev, der forklarer, at det lokale offentlige screeningprogram ville give hende en æske med en selvprøvetagningsanordning helt gratis til at udføre selv-HPV-screeningstest direkte derhjemme. Efter 1 uge sender hvert screeningsprogram, der er involveret i undersøgelsen med almindelig post hjemme hos de randomiserede kvinder, et brev med invitation til at deltage i HPV-screeningsprogrammet og en æske med: selvprøveudtagningsanordning, en HPV-screeningsfolder i brug i Toscana-regionens program. Oplysninger relateret til undersøgelsen, instruktioner til at udføre selvprøvetagning, fortrykte etiketter til at sætte på røret, formularen til informeret samtykke til underskrift, spørgeskemaet og en præ-stemplet kuvert til at returnere selvprøvetagningssættet. Spørgeskemaer vil blive sendt med selvprøveudstyr, herunder emner relateret til: datoen for kvinders seneste Pap-test, spørgsmål om selvprøveudtagningen (smerte, forlegenhed, gennemførlighed), hvad der mest blev værdsat ved selvprøvetagningen (ved at gøre det ved at sig selv, privatlivets fred, fravær af læge, fravær af spekulum) og hvad de ikke kunne lide med hensyn til selvprøvetagning (smerte, apparatet, instruktionen). Alle oplysninger vil blive indsamlet ved hjælp af 5-punkts ordinære skalaer på den generelle accept. Kvinder, der beslutter sig for at deltage i undersøgelsen, kan sende direkte med almindelig post til det lokale screeningprogram den præstemplede kuvert med selvprøveudtagningen, spørgeskemaet og det underskrevne informerede samtykke (som også vil omfatte tilladelsen til telefonisk kontakt). På andet studieår i byen Firenze vil efterforskerne også vurdere muligheden for at involvere apoteker i distributionen af ​​selvprøvetagning. I dette tilfælde vil 500 randomiserede kvinder blive inviteret pr. brev til at udføre selvprøvetagning til HPV-screeningstest ved at indsamle enheden i apoteket. En liste over apoteker, som har accepteret at blive inkluderet i undersøgelsen, vil være tilgængelig i invitationsbrevet. Indvirkningen på kvinders overholdelse og tilfredshed vil blive evalueret. Alle HPV-analyser og molekylære tests vil blive udført i Molecular Laboratory of ISPO, det centrale laboratorium for HPV-screeningstest i Toscana-regionen

DNA cobas4800 HPV test:

HPV vil blive evalueret med den samme HPV-test, der bruges i almindelig screening: Cobas 4800 HPV-testen (Roche Diagnostics) er en kvalitativ in vitro-test, der anvender amplifikation af mål-DNA ved real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) til påvisning af 14 højrisiko (HR) HPV-typer i en enkelt analyse. Det er et kvalitativt multiplex-assay, der giver specifik genotypeinformation for HPV-typerne 16 og 18, mens det samtidig detekterer de andre 12 højrisiko-HPV-typer (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 og 68) som et samlet resultat. ß-globin fra cellulært input bruges som en intern kontrol til at vurdere prøvekvaliteten. Testen udføres på det fuldautomatiske cobas 4800 System (Roche Diagnostics), i henhold til producentens anvisninger; en prøve anses for positiv i henhold til den specifikke algoritme i Cobas-systemsoftwaren.

Håndtering af indskrevne kvinder HPV-negative kvinder vil modtage resultaterne af screeningstesten derhjemme, og de inviteres igen efter 5 år i henhold til HPV-screeningsprotokollen. Alle kvinder, der resulterede i at være HPV-positive, vil blive kontaktet telefonisk for at udføre kolposkopi og en rådgivning om HPV- og livmoderhalskræftrisiko. Hvis kolposkopien er positiv, vil der blive taget en biopsi, og hver kvinde vil blive fulgt i henhold til protokollen for HPV-screeningsprogram i Toscana. Hvis kolposkopi vil være negativ, vil kvinder blive inviteret igen til at gennemgå kontrol med HPV-test inden for et års tid. Under kolposkopi vil der også blive taget en Pap-test for at vejlede den post-kolposkopiske opfølgning i henhold til den protokol, der er godkendt i Toscana-regionen. Hvis en kvinde med hr-HPV udeblev, blev der forsøgt at kontakte hende igen telefonisk og derefter også brev.

Molekylær triage af HPV-positive kvinder

HPV genotypning:

Specifik genotypebestemmelse vil blive udført i alle hrHPV-positive prøver. DNA ekstraheret vil blive genotypet. I alle HPV-positive selvopsamlede prøver vil efterforskerne udføre kvantitative methyleringsanalyser for at opnå en kvantificering af methyleringsstatus for de undersøgte CpG'er ved hjælp af DNA ekstraheret til genotypebestemmelse. Efterforskerne vil evaluere methylering af CpG-øer inden for promotorregioner af gener og mikroRNA'er, såsom CADM1 (celleadhæsionsmolekyle 1), MAL (myelin og lymfocytprotein) og hsa-miR-124- og methyleringsstatus for HPV-regionerne L1 og L2 . Efterforskerne vil for hver type undersøge de CpG'er, der er placeret i nærheden af ​​sekvenspositionen af ​​HPV16 CpG'er, som er blevet fremhævet som associeret med en øget risiko for cervikal intraepitelial neoplastisk (CIN2+) sygdom: L1 nukleotidposition 5601-5616 og 6457; L2 nukleotidposition 4261.

Bisulfitmodifikation: Genomiske DNA-prøver vil gennemgå bisulfitmodifikation ved hjælp af det kommercielle EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Det bisulfit-modificerede genomiske DNA vil blive brugt straks til pyrosekventering eller opbevaret ved -80°C.

Humane syntetiske methylerede og umethylerede DNA-kontroller for humane gener og DNA fra CaSki-cellelinje eller en WHO (World Health Organization) HPV16-DNA-kontrol for virale gener vil blive inkluderet i hvert modifikationssæt for at kontrollere modifikationseffektiviteten.

Methyleringsstatus: Methyleringsstatus i de udvalgte gener vil blive evalueret på det bisulfitmodificerede DNA. Assayene vil blive udført ved at anvende primere udvalgt i overensstemmelse med offentliggjorte sekvenser (Hesselink AT et al. Mirabello L et al, Wentzensen N et al). Når de ikke er tilgængelige, vil primere blive designet ved hjælp af en specifik software. Links til tilgængelige genbanker vil blive oprettet til gensekvensreferencer. En foreløbig PCR-reaktion vil blive udført i et samlet volumen på 35 mikroL indeholdende 1X KCl, 2mM MgCl2, 200 mikroM dNTP'er, 0,5 mikroM af hver primer (antisense biotinyleret), 1,75U Taq polymerase og 6 mikroL modificeret DNA med den korrekte termocykliske profil. Amplifikation og realtidsmåling blev udført i 7500 ABI-systemet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Bisulfit-modificerede kontroller for henholdsvis methyleret og umethyleret status af celle- og virusgen vil blive inkluderet i hver kørsel.

Genotype- og methyleringsresultater vil blive korreleret med hensyn til sensitivitet og specificitet til histologiske resultater og opfølgningsresultater hos HPV-positive kvinder med og uden klinisk meningsfuld cervikal sygdom diagnosticeret inden for en to-årig opfølgningsperiode.

Rolle for hver enhed involveret i undersøgelsen og tidslinje I det første år af undersøgelsen vil ISPO udvælge og randomisere kvinder, oprette undersøgelsesdatabasen og softwarecomputervalideringen. Æskerne og alt materiale til forsendelse af selvprøveudstyr vil blive klargjort.

Hvert screeningscenter vil invitere kvinder, sende boksen med selvprøveudtagningsudstyr, modtage selvprøveudtagningsudstyret fra de inviterede kvinder, registrere dem i databasen, sende prøverne til ISPO. ISPO L.R.P.O (Regional Oncological Prevention Laboratory) vil udføre hr-HPV-test og sende resultaterne til hvert screeningscenter. Hvert screeningscenter vil modtage hr-HPV-resultaterne fra ISPO og sende dem til kvinden. I tilfælde af HPV-positive resultater vil det lokale screeningscenter kontakte kvinden telefonisk for kolposkopisk vurdering, udføre kolposkopi og hvert yderligere opfølgningsbesøg, registrere resultaterne og spørgeskemadata i databasen og deltage i evalueringen af ​​resultaterne.

I det andet år vil ISPO evaluere muligheden for at distribuere selvprøvetagningen ved hjælp af apoteker og inviterede kvinder til dette formål ved at udføre hr-HPV-test for responderende kvinder. ISPO vil også udføre HPV-typning og methyleringsprofiler, vil registrere alle data i undersøgelsens database, udføre statistisk analyse og evaluering af resultaterne.