Selvinnsamlet prøvetaking i ikke-deltakende livmorhalskreftscreening: DNA-test og molekylær triage for HPV-positive kvinner

Studien vil bli utført i Toscana-regionen, inkludert tre organiserte screeningprogrammer: Firenze, Viareggio og Carrara. I disse områdene inviterer livmorhalsscreeningsprogrammer aktivt hele den kvinnelige befolkningen i alderen 34-64 år til HPV (Human Papilloma Virus) test som primær screeningtest (Florence og Viareggio), i henhold til den nye protokollen for livmorhalskreftscreening i Toscana-regionen, eller Pap-test hvert 3. år (Carrara). Kvinner i alderen 34-64 år som ble invitert av screeningprogrammet i forrige runde med screening og ikke hadde svart på minst 3 år, vil være kvalifisert for tilbakekalling via post.

I de 3 involverte screeningsprogrammene inviteres hvert år ca. 63.000 i aldersklassen 34-64 år til å delta på screeningprogrammet, og ca. 40 % av kvinnene svarte ikke på invitasjonen til programmet. Av dem vil 8000 kvalifiserte kvinner fortløpende valgt ut fra listene bli randomisert i to grupper. Målet er å evaluere responsraten på invitasjon til en selvinnhentet vaginal-cervikal prøve for hr-HPV-infeksjonstesting sammenlignet med standard skriftlig påminnelsesbrev. Randomisering vil bli utført sentralt av koordineringssenteret (ISPO) ved bruk av datagenererte tilfeldige tall. I det første året vil et tilfeldig utvalg på 4000 kvalifiserte kvinner fra de 4 screeningsprogrammene bli invitert til å delta i studien og sende selvprøver hjemme. I kontrollarmen vil kvinnene motta den vanlige tilbakekallingen med et nytt invitasjonsbrev med forhåndsavtale (det kan flyttes med en telefonsamtale) for å utføre HPV-screeningtest i de lokale distriktene eller klinikken. I intervensjonsarmen som er valgt for å motta selvprøvetaking hjemme, vil etterforskerne tilfeldig fordele kvinnene til 2 forskjellige selvprøvetakingsenheter som er forskjellige når det gjelder å ha eller ikke konserverende buffer.

Så gruppen kvinner som er allokert i intervensjonsarmen (4000) vil bli ytterligere randomisert 1:1 for mottak av S-våt eller S-tørr enhet.

Forutsatt at etterlevelsen for den tradisjonelle metoden med et invitasjonsbrev er lik 15 % (Giorgi Rossi 2010), er denne studien designet for å kunne oppdage en absolutt forskjell på 1,5 % eller mer i oppmøtefrekvensen med et konvensjonelt nivå på makt (80%) og signifikans (95%, en sidetest) med en planlagt utvalgsstørrelse på 8000 kvinner. Forutsatt en prøvestørrelse lik 2000 kvinner for hver prøvetakingsenhet, en signifikant forskjell lik eller større enn 4,0 prosentpoeng mer eller mindre, tatt i betraktning en HPV-positiv rate på omtrent 21 % (Giorgi Rossi 2010) med samme kraft og betydning.

Studien vil før oppstart sendes inn for godkjenning til Koordineringssenteret og Area Vasta lokale etiske komiteer. Hver kvinne i studiegruppene vil motta et varslingsbrev som forklarer at det lokale offentlige screeningprogrammet vil gi henne en boks som inneholder en selvprøvetaker helt gratis for å utføre selv-HPV-screeningtest direkte hjemme. Etter 1 uke vil hvert screeningprogram som er involvert i studien sendes med vanlig post hjemme hos de randomiserte kvinnene et brev med invitasjon til å delta i HPV-screeningprogrammet og en boks med: selvprøvetakingsenhet, et HPV-screeningshefte i bruk i Toscana-regionens program. Informasjon relatert til studien, instruksjoner for å utføre selvprøvetaking, forhåndstrykte etiketter til å sette på røret, skjemaet for informert samtykke for å signere, spørreskjemaet og en forhåndsstemplet konvolutt for å returnere selvprøvesettet. Spørreskjemaer vil bli sendt med selvprøvende enhet inkludert elementer relatert til: datoen for kvinners siste Pap-test, spørsmål om selvprøveytelsen (smerte, forlegenhet, gjennomførbarhet), hva som stort sett ble verdsatt i selvprøven (gjør det av seg selv, personvern, fravær av lege, fravær av spekulum) og hva de ikke likte angående selvprøvetaking (smerte, enheten, instruksjonen ). All informasjon vil bli samlet inn ved hjelp av 5-punkts ordinære skalaer på generell aksept. Kvinner som bestemmer seg for å delta i studien kan sende direkte med vanlig post til det lokale screeningprogrammet den forhåndsstemplede konvolutten med egenprøven, spørreskjemaet og det signerte informerte samtykket (som også vil inkludere autorisasjon for telefonkontakt). I andre studieår i byen Firenze vil etterforskerne også vurdere muligheten for å involvere apoteker i distribusjonen av selvprøvetaking. I dette tilfellet vil 500 randomiserte kvinner bli invitert per brev til å ta selvprøver for HPV-screeningtest og samle enheten i apoteket. En liste over apotek som godtok å bli inkludert i studien vil være tilgjengelig i invitasjonsbrevet. Virkningen på etterlevelse og tilfredshet for kvinner vil bli evaluert. Alle HPV-analyser og molekylære tester vil bli utført i Molecular Laboratory of ISPO, det sentrale laboratoriet for HPV-screeningtest i Toscana-regionen

DNA cobas4800 HPV-test:

HPV vil bli evaluert med den samme HPV-testen som brukes i vanlig screening: Cobas 4800 HPV-testen (Roche Diagnostics) er en kvalitativ in vitro-test som bruker amplifikasjon av mål-DNA ved sanntids Polymerase Chain Reaction (PCR) for påvisning av 14 høyrisiko (HR) HPV-typer i en enkelt analyse. Det er en kvalitativ multipleksanalyse som gir spesifikk genotypeinformasjon for HPV-type 16 og 18, samtidig som den oppdager de andre 12 høyrisiko-HPV-typene (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 og 68) som et samlet resultat. ß-globin fra cellulær input brukes som en intern kontroll for å vurdere prøvekvaliteten. Testen utføres på det helautomatiserte cobas 4800-systemet (Roche Diagnostics), i henhold til produsentens instruksjoner; en prøve anses som positiv i henhold til den spesifikke algoritmen til Cobas-systemprogramvaren.

Håndtering av påmeldte kvinner HPV-negative kvinner vil motta resultatene fra screeningtesten hjemme og de blir invitert på nytt etter 5 år i henhold til HPV-screeningsprotokollen. Alle kvinner som resulterte i å være HPV-positive vil bli kontaktet på telefon for å utføre kolposkopi og veiledning om HPV- og livmorhalskreftrisiko. Hvis kolposkopien vil være positiv, vil en biopsi bli tatt, og hver kvinne vil bli fulgt i henhold til protokollen for HPV-screeningprogrammet i Toscana. Hvis kolposkopi vil være negativt, vil kvinner bli invitert til å gjennomgå kontroll med HPV-test innen ett år. Under kolposkopi vil det også bli tatt en Pap-test for å veilede den post-kolposkopiske oppfølgingen i henhold til protokollen som er godkjent i Toscana-regionen. Dersom en kvinne med hr-HPV ikke møtte, ble det forsøkt å kontakte henne igjen på telefon og da også per brev.

Molekylær triage av HPV-positive kvinner

HPV-genotyping:

Spesifikk genotyping vil bli utført i alle hrHPV-positive prøver. DNA ekstrahert vil bli genotypet. I alle HPV-positive selvinnsamlede prøver vil etterforskerne utføre kvantitative metyleringsanalyser for å få en kvantifisering for metyleringsstatusen til de undersøkte CpG-ene, ved å bruke DNA ekstrahert for genotyping. Etterforskerne vil evaluere metylering av CpG-øyer innenfor promotorregioner av gener og mikroRNA som CADM1 (celleadhesjonsmolekyl 1), MAL (myelin og lymfocyttprotein), og hsa-miR-124- og metyleringsstatus for HPV-regionene L1 og L2 . Etterforskerne vil undersøke for hver type CpG-ene som ligger i nærheten av sekvensposisjonen til HPV16 CpG-er som har blitt fremhevet som assosiert med økt risiko for cervikal intraepitelial neoplastisk (CIN2+) sykdom: L1-nukleotidposisjonene 5601-5616 og 6457; L2 nukleotidposisjon 4261.

Bisulfittmodifikasjon: Genomiske DNA-prøver vil gjennomgå bisulfittmodifisering ved bruk av det kommersielle EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Det bisulfittmodifiserte genomiske DNAet vil bli brukt umiddelbart for pyrosekvensering eller lagret ved -80°C.

Humane syntetiske metylerte og umetylerte DNA-kontroller for menneskelige gener og DNA fra CaSki-cellelinje eller en WHO (World Health Organization) HPV16-DNA-kontroll for virale gener vil bli inkludert i hvert modifikasjonssett for å kontrollere modifikasjonseffektiviteten.

Metyleringsstatus: Metyleringsstatus i de utvalgte genene vil bli evaluert på det bisulfittmodifiserte DNAet. Analysene vil bli utført ved å bruke primere valgt i henhold til publiserte sekvenser (Hesselink AT et al. Mirabello L et al, Wentzensen N et al). Når den ikke er tilgjengelig, vil primere bli utformet ved hjelp av en spesifikk programvare. Lenker med tilgjengelige genbanker vil bli satt opp for gensekvensreferanser. En foreløpig PCR-reaksjon vil bli utført i et totalt volum på 35 mikroL inneholdende 1X KCl, 2mM MgCl2, 200 mikroM dNTPs, 0,5 mikroM av hver primer (antisense biotinylert), 1,75U Taq polymerase og 6 mikroL modifisert DNA med riktig termosyklingprofil. Amplifikasjon og sanntidsmåling ble utført i 7500 ABI-systemet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Bisulfittmodifiserte kontroller for metylert og umetylert status for henholdsvis celle- og virusgen vil bli inkludert i hver kjøring.

Genotyping og metyleringsresultater vil være korrelert med hensyn til sensitivitet og spesifisitet til histologisk utfall og oppfølgingsresultater hos HPV-positive kvinner med og uten klinisk meningsfull livmorhalssykdom diagnostisert innen en to-års oppfølgingsperiode.

Rollen til hver enhet som er involvert i studien og tidslinjen I det første året av studien vil ISPO velge ut og randomisere kvinner, sette opp studiedatabasen og programvaredatavalideringen. Boksene og alt materiell for forsendelse av selvprøvende enheter vil bli klargjort.

Hvert screeningsenter vil invitere kvinner, sende esken med selvprøveapparat, motta selvprøveapparatet fra de inviterte kvinnene, registrere dem i databasen, sende prøvene til ISPO. ISPO L.R.P.O (Regional Oncological Prevention Laboratory) vil utføre hr-HPV-testing og sende resultatene til hvert screeningsenter. Hvert screeningsenter vil motta hr-HPV-resultatene fra ISPO og sende dem til kvinnen. Ved HPV-positive resultater vil det lokale screeningsenteret kontakte kvinnen på telefon for kolposkopisk vurdering, utføre kolposkopi og hvert videre oppfølgingsbesøk, registrere resultater og spørreskjemadata i databasen og delta i evaluering av resultatene.

I det andre året vil ISPO evaluere muligheten for å distribuere selvprøvetakingen ved hjelp av apotek og inviterte kvinner til dette formålet til å utføre hr-HPV-test for responderende kvinner. ISPO vil også utføre HPV-typing og metyleringsprofiler, vil registrere alle data i databasen til studien, utføre statistisk analyse og evaluering av resultatene.