Självinsamlad provtagning i icke-deltagare livmoderhalscancerscreening: DNA-test och molekylär triage för HPV-positiva kvinnor

Studien kommer att utföras i regionen Toscana inklusive tre organiserade screeningprogram: Florens, Viareggio och Carrara. I dessa områden bjuder program för livmoderhalsscreening aktivt in hela den kvinnliga befolkningen i åldern 34-64 år för HPV-test (Human Papilloma Virus) som primärt screeningtest (Florence och Viareggio), enligt det nya protokollet för screening av livmoderhalscancer i regionen Toscana, eller Pap-test vart tredje år (Carrara). Kvinnor i åldrarna 34-64 år som hade bjudits in av screeningprogrammet i den föregående screeningomgången och som inte svarat på minst 3 år kommer att vara berättigade till mailåterkallelse.

I de tre inblandade screeningprogrammen bjuds varje år cirka 63 000 i åldersklassen 34-64 år in att delta i screeningprogrammet och cirka 40 % av kvinnorna svarade inte på inbjudan till programmet. Av dem kommer 8 000 kvalificerade kvinnor som väljs ut i följd från listorna att randomiseras i två grupper. Syftet är att utvärdera svarsfrekvensen på inbjudan till ett självanskaffat vaginalt-cervikalt prov för hr-HPV-infektionstestning i jämförelse med standardskrivet påminnelsebrev. Randomisering kommer att utföras centralt av koordineringscentret (ISPO) med hjälp av datorgenererade slumptal. Under det första året kommer ett slumpmässigt urval av 4000 kvalificerade kvinnor från de 4 screeningprogrammen att bjudas in att delta i studien och skickar självprover hem. I kontrollarmen kommer kvinnorna att få den vanliga återkallelsen med ett nytt inbjudningsbrev med en prefixerad tid (den kan flyttas med ett telefonsamtal) för att utföra HPV-screeningtest i de lokala distrikten eller kliniken. I den interventionsarm som valts ut för att ta emot självprover hemma, kommer utredarna att fördela kvinnorna slumpmässigt till 2 olika självprovtagningsenheter som skiljer sig i att ha eller inte en konserverande buffert.

Så gruppen kvinnor som tilldelas i interventionsarmen (4000) kommer att randomiseras ytterligare 1:1 för att få S-våt eller S-torr enhet.

Om man antar att följsamheten för den traditionella metoden med ett inbjudningsbrev är lika med 15 % (Giorgi Rossi 2010), är denna studie utformad för att kunna upptäcka en absolut skillnad på 1,5 % eller mer i närvarofrekvensen med en konventionell nivå på makt (80%) och signifikans (95%, ett sidotest) med en planerad urvalsstorlek på 8000 kvinnor. Om man antar en provstorlek lika med 2000 kvinnor för varje provtagningsenhet, en signifikant skillnad lika med eller större än 4,0 procentenheter mer eller mindre, med tanke på en HPV-positiv andel på cirka 21 % (Giorgi Rossi 2010) med samma kraft och signifikans.

Studien kommer att lämnas in, innan den påbörjas, för godkännande till koordineringscentret och Area Vasta lokala etiska kommittéer. Varje kvinna i studiegrupperna kommer att få ett varningsbrev som förklarar att det lokala offentliga screeningprogrammet skulle förse henne med en låda som innehåller en självprovtagningsanordning helt gratis för att utföra själv-HPV-screeningtest direkt hemma. Efter 1 vecka kommer varje screeningprogram som ingår i studien att skickas med vanlig post till de randomiserade kvinnornas hem ett inbjudningsbrev att delta i HPV-screeningprogrammet och en låda med: självprovtagningsanordning, en HPV-screeningsbroschyr i bruk i Toscana-regionens program. Information relaterad till studien, instruktioner för att utföra självprovtagning, förtryckta etiketter att sätta på tuben, formuläret för informerat samtycke för att underteckna, frågeformuläret och ett förfrimärkt kuvert för att returnera självprovtagningssatsen. Frågeformulär kommer att skickas med självprovtagningsanordning inklusive saker relaterade till: datum för kvinnors senaste Pap-test, frågor om självprovtagningsprestanda (smärta, pinsamhet, genomförbarhet), vad som mest uppskattades i självprovtagningen (genom att göra det av sig själva, integritet, frånvaro av läkare, frånvaro av spekulum) och vad de inte gillade angående självprovtagning (smärta, enheten, instruktionen ). All information kommer att samlas in med hjälp av 5-gradiga ordningsskalor på allmän acceptans. Kvinnor som bestämmer sig för att delta i studien kan skicka direkt med vanlig post till det lokala screeningprogrammet det förfrimärkta kuvertet med självprovet, frågeformuläret och det undertecknade informerade samtycket (vilket även kommer att innehålla tillstånd för telefonkontakt). Under andra studieåret i staden Florens kommer utredarna också att utvärdera möjligheten att involvera Apotek i distributionen av självprovtagning. I det här fallet kommer 500 randomiserade kvinnor att inbjudas per brev att utföra självprovtagning för HPV-screeningtest och samla in enheten i apoteket. En lista över apotek som gick med på att inkluderas i studien kommer att finnas tillgänglig i inbjudningsbrevet. Effekten på kvinnors efterlevnad och tillfredsställelse kommer att utvärderas. Alla HPV-analyser och molekylära tester kommer att utföras i Molecular Laboratory of ISPO, det centrala labbet för HPV-screeningstest i Toscana-regionen

DNA cobas4800 HPV-test:

HPV kommer att utvärderas med samma HPV-test som används vid vanlig screening: Cobas 4800 HPV-testet (Roche Diagnostics) är ett kvalitativt in vitro-test som använder amplifiering av mål-DNA genom realtidspolymeraskedjereaktion (PCR) för detektion av 14 högrisk (HR) HPV-typer i en enda analys. Det är en kvalitativ multiplexanalys som ger specifik genotypningsinformation för HPV-typerna 16 och 18, samtidigt som den detekterar de andra 12 högrisk-HPV-typerna (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 och 68) som ett sammanslaget resultat. ß-globin från cellulär input används som en intern kontroll för att bedöma provets kvalitet. Testet utförs på det helt automatiserade cobas 4800-systemet (Roche Diagnostics), enligt tillverkarens instruktioner; ett prov anses positivt enligt den specifika algoritmen för Cobas systemprogramvara.

Hantering av inskrivna kvinnor HPV-negativa kvinnor kommer att få hem resultaten av screeningtestet och de bjuds in igen efter 5 år enligt HPV-screeningsprotokollet. Alla kvinnor som resulterade i att de var HPV-positiva kommer att kontaktas per telefon för att utföra kolposkopi och rådgivning om risken för HPV och livmoderhalscancer. Om kolposkopin är positiv kommer en biopsi att tas och varje kvinna kommer att följas enligt protokollet för HPV-screeningprogrammet i Toscana. Om kolposkopi blir negativt kommer kvinnor att bjudas in igen att genomgå kontroll med HPV-test inom ett år. Under kolposkopi kommer även ett Pap-test att tas för att vägleda den postkolposkopiska uppföljningen enligt det protokoll som godkänts i Toskanska regionen. Om en kvinna med hr-HPV inte närvarade försökte man kontakta henne igen per telefon och då även per brev.

Molekylär triage av HPV-positiva kvinnor

HPV genotypning:

Specifik genotypning kommer att utföras i alla hrHPV-positiva prover. DNA som extraherats kommer att genotypas. I alla HPV-positiva självinsamlade prover kommer utredarna att utföra kvantitativa metyleringsanalyser för att erhålla en kvantifiering av metyleringsstatusen för de undersökta CpG:erna, med hjälp av DNA extraherat för genotypning. Utredarna kommer att utvärdera metylering av CpG-öar inom promotorregioner av gener och mikroRNA som CADM1 (celladhesionsmolekyl 1), MAL (myelin och lymfocytprotein) och hsa-miR-124- och metyleringsstatus för HPV-regionerna L1 och L2 . Utredarna kommer för varje typ att undersöka de CpGs som finns i närheten av sekvenspositionen för HPV16 CpGs som har markerats som associerade med en ökad risk för cervikal intraepitelial neoplastisk (CIN2+) sjukdom: L1-nukleotidpositionerna 5601-5616 och 6457; L2 nukleotidposition 4261.

Bisulfitmodifiering: Genomiska DNA-prover kommer att genomgå bisulfitmodifiering med det kommersiella EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Det bisulfitmodifierade genomiska DNA:t kommer att användas omedelbart för pyrosekvensering eller lagras vid -80°C.

Mänskliga syntetiska metylerade och ometylerade DNA-kontroller för mänskliga gener och DNA från CaSki-cellinje eller en WHO (World Health Organization) HPV16-DNA-kontroll för virala gener kommer att inkluderas i varje modifieringsuppsättning för att kontrollera modifieringseffektiviteten.

Metyleringsstatus: Metyleringsstatus i de utvalda generna kommer att utvärderas på det bisulfitmodifierade DNA:t. Analyserna kommer att utföras med användning av primers valda enligt publicerade sekvenser (Hesselink AT et al. Mirabello L et al, Wentzensen N et al). När de inte är tillgängliga kommer primers att utformas med en specifik programvara. Länkar till tillgängliga genbanker kommer att upprättas för gensekvensreferenser. En preliminär PCR-reaktion kommer att utföras i en total volym av 35 mikroL innehållande 1X KCl, 2 mM MgCl2, 200 mikroM dNTPs, 0,5 mikroM av varje primer (antisens biotinylerad), 1,75 U Taq polymeras och 6 mikroL modifierat DNA med rätt termocyklisk profil. Amplifiering och realtidsmätning utfördes i 7500 ABI-systemet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Bisulfitmodifierade kontroller för metylerad och ometylerad status för cell respektive viral gen kommer att inkluderas i varje körning.

Genotypnings- och metyleringsresultat kommer att korreleras i termer av känslighet och specificitet till histologiskt utfall och uppföljningsresultat hos HPV-positiva kvinnor med och utan kliniskt betydelsefulla livmoderhalssjukdomar som diagnostiserats inom en tvåårig uppföljningsperiod.

Rollen för varje enhet som är involverad i studien och tidslinjen Under studiens första år kommer ISPO att välja ut och randomisera kvinnor, upprätta studiedatabasen och valideringen av programvarans dator. Lådorna och allt material för utskick av självprovtagningsanordningar kommer att förberedas.

Varje screeningcenter kommer att bjuda in kvinnor, skicka lådan med självprovtagningsenhet, ta emot självprovtagningsenheten från de inbjudna kvinnorna, registrera dem i databasen, skicka proverna till ISPO. ISPO L.R.P.O (Regional Oncological Prevention Laboratory) kommer att utföra hr-HPV-testning och skicka resultaten till varje screeningcenter. Varje screeningcenter kommer att ta emot hr-HPV-resultaten från ISPO och skicka dem till kvinnan. Vid HPV-positiva resultat kommer det lokala screeningcentret att kontakta kvinnan per telefon för kolposkopisk bedömning, utföra kolposkopi och varje ytterligare uppföljningsbesök, registrera resultat och frågeformulärdata i databasen och delta i utvärderingen av resultaten.

Under det andra året kommer ISPO att utvärdera möjligheten att distribuera självprovtagningen med hjälp av apotek och inbjudna kvinnor för detta ändamål att utföra hr-HPV-test för svarande kvinnor. ISPO kommer också att utföra HPV-typning och metyleringsprofiler, kommer att registrera all data i studiens databas, utföra statistisk analys och utvärdering av resultaten.