비참석자 자궁경부암 검진에서 자가 수집 샘플링: HPV 양성 여성을 위한 DNA 검사 및 분자 분류

이 연구는 Florence, Viareggio 및 Carrara의 세 가지 조직된 선별 프로그램을 포함하여 토스카나 지역에서 수행될 것입니다. 이러한 영역에서 자궁경부암 검진 프로그램은 투스카니 지역의 자궁경부암 검진을 위한 새로운 프로토콜에 따라 HPV(Human Papilloma Virus) 검사를 위해 34-64세의 모든 거주 여성 인구를 1차 선별 검사(Florence 및 Viareggio)로 적극적으로 초대합니다. 또는 3년마다 팹 테스트(Carrara). 34-64세의 여성 중 이전 심사에서 심사 프로그램에 초대되었고 최소 3년 동안 응답하지 않은 여성은 우편 회수 대상이 됩니다.

3개의 관련된 스크리닝 프로그램에서 매년 34-64세 연령대의 약 63,000명이 스크리닝 프로그램에 참여하도록 초대되고 약 40%의 여성이 프로그램의 초대에 응답하지 않습니다. 그 중 8000명의 적격 여성이 목록에서 연속적으로 선택되어 두 그룹으로 무작위 배정됩니다. 목표는 표준 서면 알림 편지와 비교하여 hr-HPV 감염 테스트를 위해 자가 획득한 질-자궁경부 샘플에 대한 초대에 대한 응답률을 평가하는 것입니다. 무작위화는 컴퓨터 생성 난수를 사용하여 조정 센터(ISPO)에서 중앙에서 수행합니다. 첫해에 4개의 스크리닝 프로그램에서 4000명의 적격한 여성의 무작위 샘플이 집에서 자체 샘플을 보내는 연구에 참여하도록 초대됩니다. 컨트롤 암에서 여성은 지역 또는 클리닉에서 HPV 선별 검사를 수행하기 위해 접두사 약속(전화 통화로 이동할 수 있음)이 포함된 새로운 초대장과 함께 일반적인 리콜을 받게 됩니다. 집에서 자가 샘플링을 받도록 선택된 개입 부문에서 조사관은 방부제 완충제 유무가 다른 2개의 서로 다른 자체 샘플링 장치에 여성을 무작위로 할당합니다.

따라서 중재 부문(4000)에 할당된 여성 그룹은 S-wet 또는 S-dry 장치를 받기 위해 1:1로 추가 무작위 배정됩니다.

기존의 초청장 방식에 대한 순응도를 15%로 가정하고(Giorgi Rossi 2010), 본 연구에서는 기존 수준의 출석률과 1.5% 이상의 절대적인 출석률 차이를 감지할 수 있도록 설계하였다. 검정력(80%) 및 유의성(95%, 한쪽 테스트), 8000명의 여성으로 계획된 표본 크기. 샘플 크기가 각 샘플링 장치에 대해 2000명의 여성과 같다고 가정하면, HPV 양성률이 약 21%(Giorgi Rossi 2010)인 동일한 힘과 중요성을 고려하면 4.0% 이상의 상당한 차이가 있습니다.

연구는 시작하기 전에 조정 센터 및 Area Vasta 지역 윤리 위원회의 승인을 위해 제출됩니다. 연구 그룹의 각 여성은 집에서 직접 자가 HPV 선별 검사를 수행할 수 있는 자가 샘플러 장치가 들어 있는 상자를 지역 공공 선별 프로그램에서 무료로 제공할 것이라고 설명하는 경고 편지를 받게 됩니다. 1주일 후, 연구에 관련된 각 선별 프로그램은 HPV 선별 프로그램에 참여하라는 초청장과 자가 샘플 채취 장치, 사용 중인 HPV 선별 전단지가 포함된 상자를 무작위로 선정된 여성의 집으로 일반 우편으로 발송합니다. 투스카니 지역 프로그램에서. 연구 관련 정보, 자체 샘플링 수행 지침, 튜브에 붙일 미리 인쇄된 라벨, 서명할 정보에 입각한 동의서, 설문지 및 자체 샘플링 키트를 반환하기 위한 스탬프가 찍힌 봉투. 설문지는 다음과 관련된 항목을 포함하는 자체 샘플링 장치와 함께 발송됩니다: 여성의 최근 Pap 테스트 날짜, 자체 샘플링 성능에 대한 질문(고통, 당혹감, 타당성), 자체 샘플링에서 가장 높이 평가된 것(에 의해 수행) 자신, 사생활, 의사 부재, 검경 부재) 및 셀프 샘플링과 관련하여 그들이 싫어하는 것(고통, 장치, 지침). 모든 정보는 일반적으로 허용되는 5점 서수 척도를 사용하여 수집됩니다. 연구에 참여하기로 결정한 여성은 자체 샘플링, 설문지 및 서명된 사전 동의서(전화 연락 권한도 포함됨)가 포함된 미리 스탬프가 찍힌 봉투를 지역 선별 프로그램에 일반 우편으로 직접 보낼 수 있습니다. 플로렌스 시에서 연구 2년차에 조사관은 자체 샘플링 배포에 약국을 포함시킬 가능성도 평가할 것입니다. 이 경우 무작위로 추출된 500명의 여성이 약국에서 장치를 수집하여 HPV 선별 검사를 위한 자체 샘플링을 수행하도록 편지로 초대됩니다. 연구에 포함되는 데 동의한 약국 목록은 초대장에서 확인할 수 있습니다. 여성의 순응도와 만족도에 미치는 영향을 평가합니다. 모든 HPV 분석 및 분자 테스트는 투스카니 지역의 HPV 스크리닝 테스트 중앙 연구소인 ISPO의 분자 연구소에서 수행됩니다.

DNA cobas4800 HPV 테스트:

HPV는 일반 선별 검사에서 사용되는 것과 동일한 HPV 검사로 평가됩니다. Cobas 4800 HPV 검사(Roche Diagnostics)는 14종의 검출을 위해 실시간 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의한 표적 DNA의 증폭을 활용하는 정성적 체외 검사입니다. 단일 분석에서 고위험(HR) HPV 유형. HPV 16형과 18형에 대한 특이적 유전자형 정보를 제공하는 동시에 다른 12종의 고위험 HPV 유형(31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68) 풀링된 결과입니다. 세포 입력의 ß-글로빈은 표본 품질을 평가하기 위한 내부 통제로 사용됩니다. 제조업체의 지침에 따라 완전히 자동화된 cobas 4800 시스템(Roche Diagnostics)에서 테스트가 수행되고 있습니다. 샘플은 Cobas 시스템 소프트웨어의 특정 알고리즘에 따라 양성으로 간주됩니다.

등록된 여성의 관리 HPV 음성 여성은 선별 검사 결과를 집에서 받아 HPV 선별 프로토콜에 따라 5년 후에 재초청됩니다. HPV 양성 판정을 받은 모든 여성은 전화로 연락을 받아 질확대경 검사를 실시하고 HPV 및 자궁경부암 위험에 대한 상담을 받게 됩니다. 질확대경 검사가 양성이면 생검을 하고 토스카나의 HPV 선별 프로그램 프로토콜에 따라 각 여성을 추적합니다. 질확대경 검사가 음성이면 여성은 1년 이내에 HPV 검사를 통해 통제를 받도록 다시 초대됩니다. 질확대경 검사 중에 토스카나 지역에서 승인된 프로토콜에 따라 질확대경 후 후속 조치를 안내하기 위해 Pap 테스트도 수행됩니다. hr-HPV를 가진 여성이 참석하지 않으면 전화로 다시 연락한 다음 편지로 연락하기 위해 노력했습니다.

HPV 양성 여성의 분자 분류

HPV 유전자형 분석:

특정 유전자형 분석은 모든 hrHPV 양성 샘플에서 수행됩니다. 추출된 DNA는 유전자형이 결정됩니다. 모든 HPV 양성 자체 수집 샘플에서 조사관은 유전자형 분석을 위해 추출된 DNA를 사용하여 조사된 CpG의 메틸화 상태에 대한 정량화를 얻기 위해 정량적 메틸화 분석을 수행합니다. 연구자들은 CADM1(Cell adhesion molecule 1), MAL(Myelin and lymphocyte protein), hsa-miR-124-와 같은 유전자 및 microRNA의 프로모터 영역 내 CpG 섬의 메틸화와 HPV 영역 L1 및 L2의 메틸화 상태를 평가할 예정입니다. . 연구자들은 자궁경부 상피내 신생물(CIN2+) 질병의 위험 증가와 관련이 있는 것으로 강조된 HPV16 CpG의 서열 위치 근처에 위치한 CpG를 각 유형에 대해 조사할 것입니다: L1 뉴클레오티드 위치 5601-5616 및 6457; L2 뉴클레오티드 위치 4261.

바이설파이트 수정: 게놈 DNA 샘플은 상용 EpiTect 바이설파이트 키트(QIAGEN)를 사용하여 바이설파이트 수정을 거칩니다. 바이설파이트 변형 게놈 DNA는 파이로시퀀싱에 즉시 사용되거나 -80°C에서 보관됩니다.

인간 유전자에 대한 인간 합성 메틸화 및 비메틸화 DNA 대조군과 CaSki 세포주의 DNA 또는 바이러스 유전자에 대한 WHO(세계보건기구) HPV16-DNA 대조군이 변형 효율을 확인하기 위해 각 변형 세트에 포함됩니다.

메틸화 상태: 선택된 유전자의 메틸화 상태는 바이설파이트 변형 DNA에서 평가됩니다. 공개된 서열(Hesselink AT et al. Mirabello L 외, Wentzensen N 외). 사용할 수 없는 경우 프라이머는 특정 소프트웨어를 사용하여 설계됩니다. 유전자 서열 참조를 위해 사용 가능한 유전자 은행과의 링크가 설정됩니다. 예비 PCR 반응은 1X KCl, 2mM MgCl2, 200 microM dNTPs, 0.5 microM의 각 프라이머(안티센스 비오티닐화), 1.75U Taq 폴리머라제 및 6 microL 수정된 DNA를 포함하는 총 부피 35 microL에서 적절한 열 순환 프로필로 수행됩니다. 증폭 및 실시간 측정은 7500 ABI 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 수행되었습니다. 세포 및 바이러스 유전자 각각의 메틸화 및 비메틸화 상태에 대한 Bisulfite 수정 컨트롤이 각 실행에 포함됩니다.

유전형 분석 및 메틸화 결과는 조직학적 결과에 대한 민감도와 특이성, 그리고 2년 추적 기간 내에 진단된 임상적으로 의미 있는 자궁경부 질환이 있거나 없는 HPV 양성 여성의 추적 결과와 관련될 것입니다.

연구 및 타임라인에 관련된 각 단위의 역할 연구 첫 해에 ISPO는 여성을 선택 및 무작위화하고 연구 데이터베이스 및 소프트웨어 컴퓨터 검증을 설정합니다. 자체 샘플링 장치의 우편 발송을 위한 상자와 모든 자료가 준비됩니다.

각 선별진료소는 여성을 초청하여 자가채취장치가 있는 상자를 발송하고 초청된 여성으로부터 자가채취기를 수령하여 데이터베이스에 등록한 후 ISPO에 시료를 발송한다. ISPO L.R.P.O(지역종양예방연구소)에서 hr-HPV 검사를 실시하고 그 결과를 각 선별진료소로 보내드립니다. 각 선별진료소는 ISPO로부터 hr-HPV 결과를 받아 여성에게 보냅니다. HPV 양성 결과의 경우 지역 선별 센터는 질확대경 평가를 위해 여성에게 전화로 연락하고, 질확대경 및 모든 후속 방문을 수행하고, 결과 및 설문지 데이터를 데이터베이스에 기록하고 결과 평가에 참여합니다.

2년차에 ISPO는 응답 여성을 대상으로 hr-HPV 테스트를 수행하기 위해 약국 및 초대된 여성을 사용하여 자체 샘플링을 배포하는 타당성을 평가할 것입니다. ISPO는 또한 HPV 분류 및 메틸화 프로파일을 수행하고, 연구 데이터베이스에 모든 데이터를 기록하고, 통계 분석 및 결과 평가를 수행합니다.