甲型和乙型流感患者的免疫细胞亚群

背景：

2009 年 3 月底和 4 月初，墨西哥报告了一种名为 A/H1N1 流感（俗称猪流感）的新型流感病毒爆发，随后在许多国家发现了病例，导致世界卫生组织宣布全球大流行病。

以色列首例甲型 H1N1 流感病例于 2009 年 4 月底在拉尼亚多医院被诊断为一名从墨西哥返回的年轻男子。

A/H1N1 流感（猪流感）的发病率相对较高，尤其是在年轻患者中。 早期识别将能够迅速开始治疗，从而改善结果。

2009 年，在以色列 H1N1 流感大流行期间，我们儿科进行了一项研究。 研究人员 Sharon 等人。 (1) 比较了一组 53 名感染甲型 H1N1 流感的儿童和一组 53 名出现流感症状但病毒呈阴性的儿童。 这一比较表明，在疾病的急性期（第 1-3 天）淋巴细胞计数显着减少，第 7（6-9）天消退，以及从高烧开始第 5 天嗜中性粒细胞计数减少2-4 天后（第 7-10 天）的后续决议。 在未感染 H1N1 病毒的患者中未观察到这种现象。 Cao 和合著者 (2) 报告了类似的结果，他们在儿科和成人患者中都观察到了这种情况。 Lewis 等人提出，淋巴细胞减少主要是由于 T 细胞减少以及 B 细胞减少所致 (3)。 急性疾病期间甲型 H3N3 流感典型的淋巴细胞减少症显示是由于 T 细胞和 B 细胞均减少而 CD4:CD8 比率没有改变。 这与 Cao 等人的发现相反。 (2) 谁注意到一半 A H1N1 阳性患者的 CD4:CD8 比率异常。 Nichols 及其合作者 (4) 提出的一种可能解释是，流感感染患者的早期淋巴细胞减少症和晚期中性粒细胞减少症可能代表这些细胞由于感染而从循环系统迁移到受感染的呼吸道。 我们研究的目标 量化甲型 H1N1 流感引起的疾病不同阶段的 B、T 和 NK 淋巴细胞群。

研究方法 研究对象是在我们部门住院并出现流感症状和体征的儿童。 参加者的父母或法定监护人已签署书面同意书。 在第一阶段，取上呼吸道拭子以确定是否存在甲型 H1N1 流感病毒（通过 RT - PCR 进行病毒鉴定）。 然后在疾病的不同阶段量化不同亚型的淋巴细胞。 通过FACS方法对不同细胞类型进行鉴定和定量，标记的细胞受体为CD31、CD19、CD4、CD3、CD45、CD8、CD56。

实验室技术：

通过流式细胞术评估细胞标记物。 在 5 ml FACS 管中使用预冷的 PBS 对单细胞悬液进行细胞染色。 洗涤步骤通过离心 5 分钟、300 g、5°C、制动 5 完成，之后完全吸取上清液和细胞沉淀（通常含有 0.2-1.0×106 细胞）重新悬浮于补充有 0.5% 牛血清白蛋白的 100 μl PBS（不含 Ca++ 和 Mg++）中，用特异性荧光染料偶联的抗人抗体或同种型匹配的非特异性对照染色，并在冰箱中孵育 2 -8°C 30 分钟。 温育后，通过离心洗涤细胞并重悬于0.25-0.5ml冷PBS中。

测试的细胞用针对 CD45-FITC、CD45-PE 泛白细胞标记物、T 细胞标记物 CD3-PE CD8-FITC、T 辅助细胞 CD4-FITC、CD8-PE、自然杀伤 (NK) 细胞标记物 CD56 的小鼠单克隆抗体进行染色-PE、单核细胞标记物 CD31-FITC 和 B 细胞标记物 CD19-PE。

发射补偿通过含有用 CD45-FITC 或 CD45-PE 染色的细胞的阳性对照管进行；通过用 7-氨基放线菌素 D 染色排除死细胞，仅分析未染色的活细胞。 使用 CellQuest Pro 或 FlowJo 软件分析每个样本至少 10,000 个细胞事件。 不超过1％染色细胞的同种型对照抗体染色百分比用于设置“阳性”染色门，并从特异性抗体结果推导出来。 结果表示为染色细胞的百分比。