Subpopulaties van immuuncellen bij Influenza A- en B-patiënten

Achtergrond:

Eind maart en begin april 2009 werd in Mexico een uitbraak gemeld van een nieuw influenzavirus genaamd A/H1N1-influenza (in de volksmond bekend als varkensgriep), waarna in veel landen gevallen werden waargenomen, wat leidde tot de verklaring door de Wereldgezondheidsorganisatie van een wereldwijde pandemie.

Het eerste geval van influenza A/H1N1 in Israël werd eind april 2009 vastgesteld in het Laniado-ziekenhuis bij een jonge man die terugkeerde uit Mexico.

Influenza A/H1N1 (Mexicaanse griep) kent een relatief hoge morbiditeit, vooral bij jonge patiënten. Vroege identificatie zou een snelle start van de therapie mogelijk maken, waardoor de resultaten verbeteren.

In 2009, tijdens de H1N1-pandemie in Israël, werd een onderzoek uitgevoerd op onze afdeling kindergeneeskunde. De onderzoekers Sharon et al. (1) hebben een groep van 53 kinderen die besmet zijn met Influenza A H1N1 vergeleken met een groep van 53 kinderen die griepsymptomen vertoonden maar negatief werden bevonden voor het virus. Deze vergelijking toonde een significante vermindering van het aantal lymfocyten aan tijdens de acute fase van de ziekte (dag 1-3) met herstel op dag 7 (6-9) evenals een vermindering van het aantal neutrofielen op dag 5 vanaf het begin van hoge koorts met daaropvolgende resolutie 2-4 dagen later (dagen 7-10). Dit fenomeen werd niet waargenomen bij de patiënten die niet besmet waren met het H1N1-virus. Vergelijkbare resultaten werden gerapporteerd door Cao en co-auteurs (2) die het bij zowel pediatrische als volwassen patiënten waarnamen. Lewis et al suggereerden dat de lymfopenie voornamelijk te wijten is aan een vermindering van T-cellen en in mindere mate van B-cellen (3). De typische lymfopenie van influenza A H3N3 tijdens acute ziekte bleek het gevolg te zijn van een vermindering van zowel T- als B-cellen zonder verandering in de CD4:CD8-ratio. Dit in tegenstelling tot de bevindingen van Cao et al. (2) die een abnormale CD4:CD8-ratio constateerde bij de helft van degenen die positief waren voor A H1N1. Een van de mogelijke verklaringen zoals voorgesteld door Nichols en Collaborators (4) is dat vroege lymfopenie en de latere neutropenie bij met influenza geïnfecteerde patiënten migratie van deze cellen uit de bloedsomloop naar de geïnfecteerde luchtwegen kunnen vertegenwoordigen als gevolg van infectie. Doelen van ons onderzoek Het kwantificeren van de B-, T- en NK-populaties van lymfocyten tijdens verschillende stadia van de ziekte veroorzaakt door Infuenza A H1N1.

Onderzoeksmethoden De proefpersonen van het onderzoek waren kinderen die op onze afdeling waren opgenomen met tekenen en symptomen van griep. De ouders of wettelijke voogden van de deelnemers hebben een schriftelijke toestemming ondertekend. In de eerste fase werd een uitstrijkje van de bovenste luchtwegen genomen om de aanwezigheid van Infuenza A H1N1 vast te stellen (de virusidentificatie gebeurde door middel van RT - PCR). Vervolgens werden de verschillende subtypes van lymfocyten gekwantificeerd in verschillende stadia van de ziekte. De identificatie en kwantificering van de verschillende celtypen werden uitgevoerd met de FACS-methode, de gemarkeerde celreceptoren waren CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Laboratoriumtechniek:

Cellulaire markers werden beoordeeld door middel van flowcytometrie. Celkleuring werd uitgevoerd op suspensies van enkele cellen met behulp van voorgekoelde PBS in FACS-buisjes van 5 ml. Wasstappen werden uitgevoerd door gedurende 5 minuten centrifugeren, 300 g, 5 °C, rem 5, waarna supernatanten volledig werden afgepipetteerd en celpellets (typisch bevattende 0,2-1,0 x 106 cellen) werden opnieuw gesuspendeerd in 100 μl PBS (zonder Ca ++ en Mg ++) aangevuld met 0, 5% runderserumalbumine, gekleurd met specifieke fluorochroom-geconjugeerde anti-menselijke antilichamen of isotype-gematchte niet-specifieke controles en geïncubeerd in de koelkast 2 -8°C gedurende 30 min. Na incubatie werden de cellen gewassen door centrifugeren en opnieuw gesuspendeerd in 0,25-0,5 ml koude PBS.

De geteste cellen werden gekleurd met monoklonale antilichamen van de muis voor CD45-FITC, CD45-PE, een pan-leukocytenmarker, T-celmarker CD3-PE CD8-FITC, T-helpercellen CD4-FITC, CD8-PE, Natural Killer (NK)-celmarker CD56 -PE, monocytenmerker CD31-FITC en B-celmerker CD19-PE.

Emissiecompensatie werd uitgevoerd door buizen met positieve controle die cellen bevatten die waren gekleurd met CD45-FITC of CD45-PE; Dode cellen werden uitgesloten door kleuring met 7-aminoactinomycine D, alleen niet-gekleurde levensvatbare cellen werden geanalyseerd. Er werden ten minste 10.000 cellulaire gebeurtenissen per monster geanalyseerd met behulp van de CellQuest Pro- of FlowJo-software. Percentages van isotype-controle-antilichaamkleuring, niet meer dan 1% gekleurde cellen, werden gebruikt om de 'positieve' kleurpoorten in te stellen en werden afgeleid uit de specifieke antilichaamresultaten. De resultaten worden uitgedrukt als het percentage gekleurde cellen.